användning av satsodling och ett kontinuerligt odlingssystem i två steg för att studera effekten av kompletterande Bisexuell-laktalbumin och glykomakropeptid på blandade populationer av humana tarmbakterier

Abstrakt

vissa mjölkfaktorer kan främja tillväxten av en värdvänlig gastrointestinal mikroflora. Detta kan förklara varför ammade spädbarn upplever färre tarminfektioner än deras formelmatade motsvarigheter. Effekten av formeltillskott med två sådana faktorer undersöktes i denna studie. Spädbarns fekalprover användes för att jäsa formler kompletterade med glycomacropeptid och avsugning-laktalbumin i en tvåstegsförening kontinuerlig odlingsmodell. Bakteriologi bestämdes genom fluorescens in situ hybridisering. Fartyg som innehöll bröstmjölk såväl som Avsugning-laktalbumin och glykomakropeptid hade stabila räkningar av bifidobakterier medan laktobaciller ökade signifikant endast i kärl med bröstmjölk. Bacteroides, clostridia och Escherichia coli minskade signifikant i alla körningar. Acetat var den huvudsakliga syran som hittades tillsammans med höga mängder propionat och laktat. Komplettering av spädbarnsformler med lämpliga mjölkproteiner kan vara användbara för att simulera de fördelaktiga bakteriologiska effekterna av bröstmjölk.

1 Introduktion

den mänskliga tjocktarmen är ett komplext ekosystem som rymmer ett stort antal bakterier. Minst 400 olika bakteriearter tros vara närvarande vid någon tidpunkt, med upp till 1012 bakterier som finns per g avföring . Mikrofloran förvärvas vid födseln, där det sterila nyfödda koloniseras av olika bakterier under leveransprocessen . Under de första dagarna av livet dominerar näringsmässigt obehagliga prokaryoter som enterobakterier, stafylokocker och streptokocker (inklusive enterokocker). Inom den första veckan i livet etableras släkten som bifidobakterier och Bacteroides . Man tror att ammade spädbarn har en kolonflora som numeriskt domineras av bifidobakterier, medan de som matas med formel har mer komplex mikrobiota som liknar kompositionen hos vuxna . Bifidobakterier kan utöva kraftfulla antimikrobiella effekter mot en mängd olika tarmpatogener, såsom vissa Enterobacteriaceae och Clostridium spp. Som sådan ses en övervägande av bifidobakterier som en indikator på förbättrad tarmhälsa . Observationer på den normala tarmmikrofloran har till stor del härletts från kvantitativ plattkultur och fenotypisk karakterisering, som har begränsningar när det gäller återhämtningseffektivitet och operatörssubjektivitet .dessutom, eftersom den proximala kolon är fysiskt otillgänglig för rutinmässiga ändamål, har majoriteten av mikrobiella studier på jäsning utförts med fekala bakterier i antingen satsodling eller enstegs kemostater . Batchkultur möjliggör en bestämning av fermenterbarheten hos olika substrat under korta perioder (24 h). Emellertid finns markerade skillnader i substrattillgänglighet och miljöförhållanden mellan den proximala och distala kolon, som inte kan simuleras i ett enda kärlsystem .

däremot har in vitro-system som använder flera fermentationskärl i serie fördelar genom att kunna modellera mer komplexa miljöförhållanden samtidigt som de möjliggör rumslig och tidsmässig heterogenitet . Till exempel visades en tvåstegs kemostat med cellåtervinning från det andra till det första steget för att ge tillfredsställande resultat . Ytterligare förfining för modellering av den vuxna mänskliga kolon utfördes av Macfarlane et al. med användning av en tre-stegs förening kontinuerligt odlingssystem. Detta validerades mikrobiologiskt mot humant kolonmaterial erhållet från plötsliga dödsoffer vid obduktion. Sådana modeller är värdefulla för att studera tarmmikrofloran eftersom olika fysikalisk-kemiska förhållanden kan kontrolleras. Detta har tydliga ekonomiska fördelar, men är särskilt relevant för planering av mänskliga studier.

skillnader i fekalfloran återspeglas också i varierande laktat -, kort-(SCFA) och grenade fettsyramönster som är mellanliggande och slutprodukter av bakteriell jäsning . Deras produktionshastighet och fermentationsmönster kan också bestämmas av substrattillgänglighet för tarmbakteriefloran . Därför kan förändringar i fekalfloran från en förändring i kosten eller antimikrobiell terapi också medföra en förändring i fermentationsmönstren och koncentrationen av organisk syra . Mängden sådana syror som produceras hos människor är svår att bestämma och endast ett litet antal studier har utförts som indikerar att hos vuxna produceras mellan 300 mmol och 1-2 mol syra varje dag. Acetat visade sig vara den huvudsakliga SCFA som produceras i alla fall och bevis tyder på att caecal SCFA-koncentrationer är ungefär dubbla i rekto-sigmoidområdet .

två mjölkkomponenter har tidigare visat sig hämma gastrointestinala infektioner och / eller stimulera bifidobakterier in vitro. Glycomacropeptide (GMP), ett derivat av Tubi-kasein, har studerats ingående in vitro och har visat sig hämma vidhäftningen av bakterier, virus och toxiner till cellmembranet genom bindning till patogenens receptorställen . Dessa in vitro-analyser visade också att GMP starkt främjade tillväxten av Bifidobacterium breve, B. bifidum, B. infantis och Lactococcus lactis. det har visat sig att det har liknande effekter att det har en tertiär struktur som är jämförbar med lysozymer av c-typ . Pihlanto-Lepp O.D. tidigare visade att den metaboliska aktiviteten av Escherichia coli JM103 sänktes till endast 21% av den normala. Dessutom visade testningen av renad komjölk att Bisexuell-la var en potent tillväxtpromotor för B. infantis och B. breve.

i den här studien använde vi batchkultur och ett tvåstegs sammansatt kontinuerligt odlingssystem för att testa fermentationsegenskaper och bakterieaktiviteter efter tillskott av spädbarnsformelfoder med Bisexuell-la och GMP. Det kontinuerliga kultursystemet anpassades från den trestegsmodell som utvecklats av Macfarlane et al. . Dess mindre driftsvolym och snabbare omsättningshastigheter försökte redogöra för de fysiska faktorer som finns hos mänskliga spädbarn. Vi testade om komplettering av Macau-la och GMP kan förändra mag-tarmfloran för att ge liknande fördelar som de som observerats hos ammade spädbarn.

2 Material och metoder

2,1 Batchkultur

för de anaeroba batchkultursystemen innehöll basalkulturmediet (per liter): 1 g pepton, 1 g jästextrakt, 0,05 g NaCl, 0,02 g K2HPO4, 0,02 g KH2PO4, 0,005 g MgSO4·7H2O, 0,005 g CaCl2·6H2O, 1 g NaHCO3, 1 ml tween 80, 0.0025 g Hemin, 5 oc vitamin K1, 0,25 g cystein HCl och 0,25 g gallsalter lösta i 500 ml avjoniserat vatten, justerat till pH 7,0 och steriliserat genom autoklavering. Alla kemikalier erhölls från Sigma (Poole, Dorset, Storbritannien) om inte annat anges. Sterilt medium (50 ml) placerades i 100 ml satsodlingsflaskor innehållande 0,5 g (1% w/v) av en testformel (Arla Foods Ingredients, Viby, Danmark) kompletterat med antingen 68% W/v) eller GMP (80% w/v) och hölls under en atmosfär av syrefri kvävgas. Formlerna jämfördes med en standard innehållande 1% (vikt/vikt) laktos. Följande dag samlades ett nytt fekalprov i en stomacherpåse och behandlades omedelbart. Experimentet upprepades fem gånger med fem olika givare.

satsodlingskärlen inokulerades med 5 ml av en 10% (vikt/volym) fekal uppslamning från friska vuxna frivilliga beredda med anaerob fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 0,1 m, pH 7,2) och 1 ml prover togs vid gånger 0 (innan provet placerades i satsodling), 6 h och 24 h och lagrades vid 4 c c tills vidare användning. För räkning av bakterier genom fluorescerande in situ-hybridisering (FISH) avlägsnades 375-oc-l triplikat av uppsamlat prov och tillsattes till ett 1,5 ml Eppendorf-rör innehållande 1125 oc-l filtersteriliserat 4% (vikt/volym) paraformaldehyd i PBS (pH 7,2) och fixerades i minst 4 timmar vid 4 oc-l C. Det fasta provet centrifugerades sedan i 5 minuter vid 13 000 oc-l g och supernatanten kasserades. Pelleten återsuspenderades i 1 ml filtrerad PBS (pH 7,4) innehållande 0,00001% (vikt/volym) cetyltrimetylammoniumbromid och överfördes till ett Eppendorf-rör för avstötning (13 000 kg, 5 min). Efter tvättning av pelleten en andra gång avlägsnades supernatanten och pelleten resuspenderades noggrant i 150 kg filtrerad PBS och 150 kg 96% (v/v) etanol. Provet blandades väl och lagrades vid -20 C i minst 1 timme före hybridisering med en fluorescerande sond (som beskrivs nedan).

2.2 tvåstegs kontinuerligt odlingssystem

det kontinuerliga odlingssystemet bestod av två glaskärl, V1 och V2, båda med en arbetsvolym på 100 ml. Temperatur (37 CCG) och pH kontrollerades automatiskt. Kultur pH i kärlen var 5.2 i V1, som representerar den låga pH-miljön i den proximala kolon och 6,5 i V2, vilket indikerar ett mer neutralt pH i den distala kolon. Varje fermentor omrördes magnetiskt och tillväxtmediet sparged kontinuerligt med syrefritt kväve (15 ml min-1) och matades från en glasmedium reservoar av en peristaltisk pump (Watson−Marlow, Falmouth, Storbritannien) till V1. V1 levererade sekventiellt V2 via ett överflöde och en serie dammar. Överflödet från V2 leddes till en avfallsbehållare. Odlingsmediet bestod av (A) det basala mediet som beskrivits ovan med 1% (w/v) laktos tillsatt (Sigma, Poole, Dorset, UK), (B) human bröstmjölk (tillhandahållen av Royal Berkshire Hospital, Reading, UK) med 0,5 g l−1L-cystein-HCl tillsatt, (C) testformel med 68% (w/v) kompletterande Bisexuell-la, 1% (w/v) laktos och 0,5 g l−1L-cystein-HCl och (D) testformel med 68% (w/v) kompletterande w/v) GMP, 1% (W / V) laktos och 0,5 g l−1L-cystein-HCL. Alla formler erhölls från Arla-livsmedelsingredienser (Viby, Danmark) och predigested med användning av pepsin (575 U per g protein) vid pH 2 för 2 h (37 kg C), följt av pankreatin (50 U PER g protein) och 0,5 g L−1 volym gallsyra vid pH 6,5 För två timmar (37 kg c). För att säkerställa anaerobicitet kokades 4 ml l−1 av en 250 mg l−1 stamlösning av resazurin och tillsattes till mediet. Medierna upphettades sedan till 80 cc20 min, kyldes till rumstemperatur över natten och upphettades till 80 cc20 min innan de kontinuerligt spargades med O2-fri N2. Systemet drivs med en retentionstid (R) på 12 h, beräknad som den ömsesidiga utspädningshastigheten. Systemretentionstid utgjorde summan av individuella R-värden i varje fermentor. Varje fermentor inokulerades med 15 ml av en färsk 10% (vikt/volym) fekal uppslamning från friska spädbarnsdonatorer mellan 1 och 6 månaders ålder och matades bröstmjölk med kompletterande formel. Uppslamningen framställdes med användning av anaeroba 0,1 M PBS (pH 7,2). Alla experiment upprepades fem gånger med olika givare med undantag för grupp B (bröstmjölk), där experimentet utfördes en gång med användning av fekalmaterialet hos en 3 månader gammal, uteslutande ammad givare. Grupperna C och D innehöll var och en fem olika individer. Prover togs efter 1, 3 och 6 månaders ålder för att bedöma eventuella skillnader i fekal mikroflora och eventuella förändringar i effektiviteten hos kosttillskott när spädbarnen mognade. Jäsningssystemet fick jämviktas över natten innan mediumpumpen startades och kördes i minst 144 timmar för att fastställa steady state-förhållanden. 3 ml prov av det ursprungliga inokulatet (N), efter jämvikt (T0) och vid steady state-förhållanden (TS) togs och bereddes för FISKANALYS enligt beskrivningen ovan.

2.3 bakteriell uppräkning genom fisk

Oligonukleotidprober (Tabell 1) för Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp./ Enterococcus, Bacteroides spp. , Clostridium histolyticum group och E. coli syntetiserades och monomärktes vid 5 ‘ – änden med Cy3 (Ex 552 nm, Em 568 nm) av antingen Eurogentec (Abingdon, UK) eller MWG-Biotech (Milton Keynes, UK). Hybridisering utfördes över natten vid 50 CCB för Bifidobacterium och Clostridium, vid 45 CCB för Lactobacillus och Bacteroides och vid 37 CCB för E. coli. För hybridisering tillsattes 200 occl filtrerad buffert (40 mM Tris–HCl pH 7,2, 1,8 M NaCl) innehållande 20 ml l−1 av 10% (w/v) SDS och 64 occl HPLC-vatten till 16 occl fasta celler och värmdes till lämplig temperatur. Föruppvärmd hybridiseringslösning (90 kokl) tillsattes till 10 kokl av lämplig sond (slutlig koncentration 50 kokl−1) och lösningen inkuberades över natten i en hybridiseringsugn. För E. coli-sonden tillsattes 264 oc h hybridiseringsbuffert innehållande 35% (v/v) formamid till 16 oc h fasta celler. Cellerna tvättades genom tillsats av 5 ml tvättbuffert (20 mM Tris–HCl pH 7,2, 0,9 M NaCl) till 5-100 oc hybridiserat prov, färgades med 20 oC 4’,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, Ex 344, Em 450; 500 ng ml−1) och inkuberades i en hybridiseringsugn i 30 minuter. För totalt antal prov vakuumfiltrerades 5-12 oc-l prov på ett 0,2-oc-m porstorlek polykarbonatfilter (Millipore, Watford, Storbritannien) och placerades på ett mikroskopglas. För att undvika blekning av sonderna tillsattes en droppe SlowFade-Light Antifade Kit komponent a (Molecular Probes Europe, Leiden, Nederländerna) till filtret. Diabilder undersöktes mikroskopiskt med användning av en Epi-fluorescens fastsättning (Nikon Storbritannien, Kingston upon Thames, Storbritannien). UV-ljus användes för att räkna DAPI-färgade bakterier och Cy3-färgade celler räknades upp vid 550 nm. Femton slumpmässiga fält med en bra fördelning av celler (10-100) räknades för varje sond och prov.

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

2.4 Volatile acid analysis

Undiluted aliquots (1.0 ml) prov dispenserades i 1,5 ml Eppendorf-rör och centrifugerades (13 000 ci, 5 min) till pelletsbakterier och andra fasta ämnen. Supernatanten filtrerades sedan med användning av ett 0,2-occolm polykarbonatfilter och tillsattes till fyra delar acetonitril innehållande 4,3 mmol l−1 av 2-etylsmörsyra som intern standard. Kalibrering gjordes med användning av standardlösningar av ättiksyra, propionsyra, i-smörsyra, n-smörsyra, i-valerinsyra, n-valerinsyra, n-kapronsyra och dl-mjölksyra i acetonitril. Fettsyror bestämdes genom gas-vätskekromatografi på ett Agilent 6890-serie GC-system (Agilent, Waldbronn, Tyskland) utrustat med en Optima FFAP-kolonn (25 m 0,32 mm, 0,32 mm, Macherey-Nagel, D, Tyskland) och en flamjoniseringsdetektor. Bärargashelium levererades med en flödeshastighet av 1,8 ml min−1. Injektor, kolonn och detektor sattes till 220 CCB, 140 CCB (isoterm)respektive 220 CCB. Efter 5 min kolonntemperaturen ökades till 240 cc20 cc1 steg för att köra ytterligare 15 min. Peaks integrerades med hjälp av en PC som kör Atlas Lab managing software (Thermo Lab Systems, Mainz, Tyskland). Fettsyrakoncentrationer beräknades genom att jämföra deras toppområden med de i den interna standarden och uttrycktes som millimol per liter.

2.5 statistisk analys

statistisk analys utfördes med användning av envägs ANOVA (inokulum, versus steady-state, TS) för bestämning av signifikans vid P<0.05 om inte annat anges.

3 resultat

3.1 Batchkultur

före inokulering innehöll prover nästan identiska antal Bifidobacterium spp., Bacteroides spp. och Clostridium spp. Laktobaciller var mindre talrika. I kulturer som innehåller Asia-la (Fig. 1), totala räkningar, bifidobakterier, clostridier, laktobaciller och bakteroider förblev oförändrade. E. coli-antalet minskade signifikant (P<0,01) med tillägg av 6 timmar efter inkubation av 6 timmar, men ökade igen till baslinjenivåer (visas inte).

1

genomsnittligt antal bakterier (log10) i vuxen fekal inokulum och satskulturer innehållande basmedium med 1% (vikt/vikt) laktos) eller 1% (vikt/vikt) testformel. Resultaten är medel (log10 per g våtvikt) bisexuell S. D. n=fekal inokulum; 24 h, laktos=kultur efter 24 h inkubation innehållande laktos; 24 h, a-la/GMP=kultur efter 24 h inkubation innehållande Xiaomi-la eller GMP.

1

genomsnittligt antal bakterier (log10) i vuxen fekal inokulum och satsodlingar innehållande basmedium med 1% (vikt/vikt) laktos) eller 1% (vikt/vikt) testformel. Resultaten är medel (log10 per g våtvikt) bisexuell S. D. n=fekal inokulum; 24 h, laktos=kultur efter 24 h inkubation innehållande laktos; 24 h, a-la/GMP=kultur efter 24 h inkubation innehållande Xiaomi-la eller GMP.

kulturer som innehåller GMP (Fig. 1) i allmänhet upprätthålls antal bifidobakterier, Bacteroides, lactobacilli och clostridia. Antalet E. coli minskade signifikant (P<0,05) efter 6 timmars inkubation men ökade igen till basala nivåer (visas inte).

3.2 tvåstegs förening kontinuerligt odlingssystem

i kärl som innehåller samma standardmedium (basmedium innehållande 1 viktprocent laktos, Fig. 2) förblev totala bakterieantal, bifidobakterier, laktobaciller och clostridier konstanta. Däremot ökade Bacteroides signifikant i båda fermentationskärlen efter jämvikt och förblev högre än inokulumnivåerna vid steady state i båda kärlen (P<0,05). En statistiskt signifikant minskning (P<0,05) kunde observeras för E. coli i kärl 2 (pH 6,5) efter jämvikt. Detta upprätthölls emellertid inte och båda kärlen hade jämförbara E. coli-nivåer vid steady state, som var lägre än inokulatet.

2

genomsnittligt antal bakterier (log10) i fekala inokulum-och kontrollfermenterkärl med basmedium innehållande 1% (vikt/vikt) laktos eller bröstmjölk (BM). Resultaten är medel (log10 per g våtvikt) bisexuell S. D. n=fekal inokulum; V1TS=kärl 1 vid steady state (pH 5.2); V2TS=kärl 2 vid steady state (pH 6.5).

2

genomsnittligt antal bakterier (log10) i fekala inokulum-och kontrollfermenteringskärl med basalt medium innehållande 1% (vikt/vikt) laktos eller bröstmjölk (BM). Resultaten är medel (log10 per g våtvikt) bisexuell S. D. n=fekal inokulum; V1TS=kärl 1 vid steady state (pH 5.2); V2TS=kärl 2 vid steady state (pH 6.5).

efter kärlen som innehåller bröstmjölk (Fig. 2) lämnades för att jämvikta i 24 timmar, en statistiskt signifikant ökning (P<0,05) observerades för laktobaciller i kärl 2 (pH 6.5), som behölls tills steady state uppnåddes. Antalet bifidobakterier förblev stabila. Däremot minskade clostridia (P<0, 01) signifikant i båda kärlen och försvann helt från kärl 1 (pH 5, 2) vid steady state. Liknande minskningar (P<0,05) observerades för E. coli i kärl 1 (pH 5,2) men inte i kärl 2 (pH 6,5). Kärl som innehöll sackaros-La och inokulerade med fekalprover erhållna från 1-och 3-månader gamla spädbarn hade stabila totala räkningar samt nivåer av andra bakterier (visas inte). När jäsarna inokulerades med fekalprover erhållna från 6 månader gamla spädbarn (Fig. 3), totala räkningar och laktobaciller var oförändrade. Antalet bakterier, clostridier och E. coli minskade märkbart efter jämvikt och en statistiskt signifikant minskning (P<0,05) observerades vid båda pH-nivåerna. Fartyg som innehöll GMP och inokulerade med fekalprover från 1-och 3-månader gamla spädbarn hade totala räkningar, Bacteroides och E. coli som fluktuerade men förblev stabila. Som observerats med sackarios-la visade laktobaciller en liten uppåtgående trend jämfört med de ursprungliga proverna, men statistisk signifikans observerades inte (ej visad). När jäsarna inokulerades med avföring från 6 månader gamla spädbarn (Fig. 3), totala räkningar, laktobaciller och bifidobakterier förblev oförändrade. Antalet Bacteroides, clostridium och E. coli minskade märkbart efter jämvikt och en statistiskt signifikant reduktion (P<0,05), liknande den som ses med formel för komplettering av den med den med tillägg av den med den med tillägg av den med den med tillägg av den med den med tillägg av den med den med tillägg av den med den med tillägg av den med den med den med tillägg av den med den, observerades vid båda pH-nivåerna.

3

medelvärde för bakterieantal i inokulum-och jäsningskärl (log10) som innehåller XXL-la eller GMP med avföring från 6 månader gamla donatorer. Resultaten är medel (log10 per g våtvikt) bisexuell S. D. n=fekal inokulum; V1TS=kärl 1 vid steady state (pH 5.2); V2TS=kärl 2 vid steady state (pH 6.5).

3

medelvärde för bakterieantal i inokulum-och jäsningskärl (log10) som innehåller XXL-la eller GMP med avföring från 6 månader gamla donatorer. Resultaten är medel (log10 per g våtvikt) bisexuell S. D. n=fekal inokulum; V1TS=kärl 1 vid steady state (pH 5.2); V2TS=kärl 2 vid steady state (pH 6,5).

3,3 organiska syror

totala mängder organiska syror varierade signifikant statistiskt (P<0,05) mellan inokulaen och provtiderna med genomsnittlig total syra för inokulaen 4,28 mmol l−1, 8,16 mmol l−1 och 15,64 mmol l−1 jämfört med 73,80 mmol/l−1 (intervall 18,93–160,49), 39,29 mmol l−1 (intervall 15,30–100,28) och 80,49 mmol l−1 (intervall 28,07–177,34) för 1-, 3 – och 6 månader gamla givare respektive. Standardfel var 4.96%, 3.10%, 2.61%, 1.80%, 0.91%, 0.84%, 1.91% och 5.12% för acetat, propionat, i-butyrat, n-butyrat, i-valerat, n-valerat, kaproat respektive laktat. Acetat var den dominerande syran i alla grupper (Fig. 4) följt av laktat och propionat, i genomsnitt 63%, 21%, 11% av den totala syran respektive. d (-) – laktat hittades huvudsakligen jämfört med l (+) – laktat som endast inträffade sporadiskt och i minimala mängder. Inga statistiskt signifikanta skillnader hittades mellan studiegrupper för isosyror, valerat och kaproat, som inträffade i spårmängder.

4

genomsnittliga relativa mängder ( % ) syra i jäsningskärl. Dieter: N=inokulum; a-la (sackaros-la)=sackaros-laktalbumin; GMP=glykomakropeptid; BM=bröstmjölk. Donatorålder: 1=1 månad; 3=3 månader; 6=6 månader efter födseln.

4

genomsnittliga relativa mängder ( % ) syra i jäsningskärl. Dieter: N=inokulum; a-la (sackaros-la)=sackaros-laktalbumin; GMP=glykomakropeptid; BM=bröstmjölk. Donatorålder: 1=1 månad; 3=3 månader; 6=6 månader efter födseln.

det fanns dock en statistiskt signifikant skillnad (P<0.05) mellan grupperna för de relativa mängderna av de stora syrorna och n-butyrat. Acetat och laktat uppträdde i allmänhet i ett förhållande av 3: 2 med undantag för inokulatet hos 6 månader gamla spädbarn, där laktat dominerade (P<0, 01). n-Butyratkoncentrationer ökade generellt med givaråldern medan propionat minskade tills båda var ungefär lika i koncentration. Små mängder i-butyrat hittades också i alla donatoråldersgrupper såväl som i bröstmjölksgruppen.

4 diskussion

baserat på tidigare studier antas det allmänt att ammade spädbarn kan dra nytta av mikrobiota som numeriskt domineras av bifidobakterier och / eller laktobaciller . tidigare har man funnit att man stimulerar utvalda rena kulturer av bifidobakterier in vitro. Liknande resultat sågs dock inte här i blandad kultur. I preliminära satskulturer inokulerade med vuxen fekalmaterial observerades ingen statistiskt signifikant effekt på den fördelaktiga mikrofloran. Detsamma gällde för båda tillskotten när de användes i kontinuerlig odling inokulerad med fekalmaterial från spädbarn i olika åldersgrupper. Trots detta var bifidobakterier den dominerande gruppen i både testformlerna och bröstmjölkskontrollen, där bifidobakterier också förblev konstanta under hela experimentet. En djupare effekt sågs för laktobaciller. Bröstmjölk ökade signifikant laktobaciller. En mindre, men statistiskt obetydlig ökning av antalet laktobaciller visades med GMP i feces hos 3 månader gamla spädbarn, en trend som fortsatte i experiment med fekalmaterial hos 6 månader gamla spädbarn.

båda formeltillskotten tros också ha någon hämmande effekt på en mängd olika patogener. GMP visade sig tidigare ha flera antipatogena attribut i både dess kolhydratkedja innehållande N-acetylneuraminsyra (sialinsyra) såväl som i dess polypeptiddel . Närvaron av sialinsyror på ytan av tarmceller krävs ofta för infektion av en mängd olika enteriska patogener och en exogen källa till GMP kan hämma bakteriell vidhäftning, vilket är nödvändigt för infektion. Detta har visats av Kawakami genom att hämma vidhäftningen av enteropathogen E. coli till humana tarmcellinjer. I allmänhet är koncentrationen av sialinsyrainnehållande komponenter högre i bröstmjölk än i spädbarnsformler. En hämmande effekt av GMP på Bacteroides, clostridia och E. coli, tre potentiellt patogena organismer, observerades i denna studie. Medan i preliminära satskulturer med användning av vuxna fekala materialräkningar i allmänhet bevarades, sågs en nedåtgående trend i kontinuerlig kultur. En statistiskt signifikant reduktion av dessa organismer detekterades emellertid endast i kulturer som kör fekalmaterial av 6 månader gamla spädbarn. Liknande resultat observerades i bröstmjölk, vilket signifikant minskade clostridia och E. coli medan Bacteroides förblev oförändrade. Däremot ökade basalmediet signifikant nivåer av Bacteroides som visar att förändringar i floraens sammansättning inte var ett resultat av tvätt utan berodde på fermentationsmediet.

Aa, en reglerande komponent av laktossyntas, delar en hög nivå av sekvensidentitet till c-typ lysozymer och har en liknande tredimensionell struktur som tyder på att de kom från en gemensam förfädergen . Flera studier har utförts för att antyda att sackaros-la kan ha liknande effekter på patogener . I kontrast, Pelligrini et al. fann att proteolytisk digestion av trypsin och pepsin gav tre peptider med bakteriedödande egenskaper, mestadels aktiva mot gramnegativa organismer. Bakteriostatiska egenskaper hos hydrolyserad Xiaomi-la sågs specifikt för E. coli. I denna studie observerades en hämmande effekt av AUC-la på Bacteroides, clostridia och E. coli. Återigen detekterades en statistiskt signifikant reduktion av dessa organismer endast i kulturer som kör fekalmaterial av 6 månader gamla spädbarn, ett resultat som är jämförbart med det som erhållits för bröstmjölkskontroller.

vår studie bekräftade att acetat var den huvudsakliga SCFA hos ammade jämfört med flaskmatade spädbarn tillsammans med låga koncentrationer av propionat och en nästan total frånvaro av butyrat under de första 117 dagarna av livet . Laktat och acetat inträffade generellt i ett 2: 3-förhållande, vilket bekräftar bifidobakteriernas dominerande roll i mikrofloran som beskrivs av Rasic och Kurmann . En hög förekomst av laktat är också typisk för ofullständig eller snabb jäsning som vanligtvis förknippas med ett surt pH som ses hos ammade barn . Detta bekräftades emellertid inte här eftersom fekal inokulum av ammade givare som fermenterade bröstmjölk producerade en syraprofil nästan helt utan laktat. Å andra sidan producerade fekalprover som fermenterade formeln för användning i form av en formel med en syraprofil som är karakteristisk för formelfermentering med högre koncentrationer av n-butyrat, vilket ökade med givaråldern . Acetat förblev emellertid fortfarande dominerande, vilket ses hos uteslutande ammade spädbarn.

Sammanfattningsvis har vi visat de mikrobiologiska effekterna av komplettering av spädbarnsformler med Bisexuell-la och GMP. Jämfört med tidigare in vitro-studier med rena kulturer av bifidobakterier observerades inte en bifidogen effekt av de två tillskotten med fekal inokula. Emellertid observerades en statistiskt signifikant reduktion av den potentiellt patogena mikrofloran som liknade den som observerades hos ammade spädbarn. Således kan man i detta sammanhang dra slutsatsen att tillskott av extrakter av kakao-la och GMP i kombination med höga mängder acetat har gynnsamma effekter på den mänskliga mikrofloran.

bekräftelser

forskarna vill tacka Alethea Hill samt givarna och deras föräldrar för deras stöd, entusiasm och ovärderlig hjälp för studien.

Borriello
S. P.

(

1986

)

mikrobiell flora i mag-tarmkanalen

. I:

mikrobiell Metabolism i mag-tarmkanalen

(

Hill
M. J.

, Red.), PP.

2 div– –

16

.

CRC Tryck

,

Boca Raton, FL

.

från Sonnenborn
U.
Stobernack
H.-P.
Proppert
Y.

(

1990

)

utvecklingen av anaerob tarmflora hos nyfödda

.

framsteg. Med.
108

,

420

424

.

Mitsuoka
T.

(

1995

)

jämförande intestinal mikrobiell ekologi och metabolism hos människor och djur

. I:

medicinska och dentala aspekter av anaerober

(

Duerden
B. I.

Wade
W. G.

Brazier
J. S.

Eley
A.

Wren
B.

Hudson
M. J

, Red.), PP.

87

107

.

vetenskap recensioner

.

H. J. M.
Raangs
G. C.

et al. (

2000

)

analys av tarmflorautveckling hos ammade och formelmatade spädbarn med hjälp av molekylära identifierings-och detektionsmetoder

.

J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr.
30

,

61

67

.

Salminen
S.

Bouley
C.

Boutron-Ruault
M.-C.

et al. (

1998

)

funktionell livsmedelsvetenskap och gastrointestinal fysiologi och funktion

.

Br. J. Nutr.
80

,

S147

S171

.

Harmsen
H. J. M.

Gibson
G. R.

et al. (

1999

)

jämförelse av fungerande cellantal och fluorescens in situ hybridisering med användning av specifika rRNA-baserade sonder för kvantifiering av humana fekala bakterier

.

FEMS Microbiol. Lett.
183

,

125

129

.

Macfarlane
G. T.

Gibson
G. R.

Macfarlane
S.

(

1994

)

kortkedjig fettsyra-och laktatproduktion av humana tarmbakterier odlade i batch och kontinuerlig odling

. I:

kortkedjiga fettsyror

(

bindemedel
H. J.

Cummings
J. H.

Soergel
K. H.

, Red.), PP.

44

60

.

Kluwer Publishing

,

London

.

Allison
McFarlan
C.
Macfarlane
G. T.

(

1989

)

studier av blandade populationer av humana tarmbakterier odlade i kontinuerliga odlingssystem i ett och flera steg

.

Appl. Ungefär. Mikrobiol.
55

,

679

683

.

Marsh
P.

(

1995

)

rollen av kontinuerlig kultur i modellering av den mänskliga mikrofloran

.

J. Chem. Teknik. Bioteknol.
64

,

1 div– –

9

.

Veilleux
B. G.

Rowland
I.

(

1981

)

simulering av råtttarmen ekosystem med hjälp av ett tvåstegs kontinuerligt kultursystem

.

J. Gen. Microbiol.
123

,

103

115

.

Macfarlane
Macfarlane
S.

Gibson
G. R.

(

1998

)

valideringen av ett trestegs sammansatt kontinuerligt odlingssystem för undersökning av effekten av retentionstid på ekologi och metabolism av bakterier i humant kolon

.

mikrob. Ecol.
35

,

180

187

.

Edwards
C. A.

Parrett
A. M.

Balmer
S. E.

Wharton
B. A.

(

1994

)

fekala kortkedjiga fettsyror hos ammade och formelmatade spädbarn

.

Acta Paediatr.
83

,

459

462

.

Cummings
J. H.

(

1983

)

jäsning i den mänskliga tjocktarmen: bevis och konsekvenser för hälsan

.

lansett
1

,

1206

1208

.

Midtvedt
T.

Carlstedt-Duke
B.

h T.

et al. (

1986

)

påverkan av peroral antimikrobiell på den biotransformatoriska aktiviteten i tarmmikrofloran hos friska försökspersoner

.

Eur. J. Blink. Investera.
16

,

11

17

.

Kawakami
H.

(

1997

)

Biological significance of sialic acid-containing substances in milk and their application

.

Recent Res. Dev. Agric. Biol. Chem.
1

,

193

207

.

Idota
T.

Kawakami
H.

Nakajima
I.

(

1994

)

Growth-promoting effects of N-actelylneuraminic acid containing substances on bifidobacteria

.

Biosci. Biotechnol. Biochem.
58

,

1720

1722

.

Bouhallab
S.

Favrot
C.

Maubois
J. L.

(

1993

)

tillväxtfrämjande aktivitet av tryptisk digest av kaseinomakropeptid för Lactococcus lactis ssp. lactis

.

mjölk
73

,

73

77

.

Xue
Y.

Lui
J. N.

Sun
Z.

Matt
Z.
Wu
C.
Zhu
D.

(

2001

)

acuc-laktalbuminmutant som verkar som lysozym

.

proteiner Struct. Funct. Genet.
42

,

17

22

.

Pihlanto-Lappubbilliclu
A.

Marnila
P.

Hubert
L.

Rokka
T.

Korhonen
H. J. T.

Carpal
M.

(

1999

)

effekten av pankreas-laktalbumin och pankreas-laktalbuminhydrosylater på den metaboliska aktiviteten hos Escherichia coli jm103

.

J. Appl. Mikrobiol.
87

,

540

545

.

Petschow
BW

Talbott
D.

(

1991

)

svar på Bifidobacterium arter till tillväxtpromotorer i human och komjölk

.

Pediatr.
29

,

208

213

.

Franks
A. H.

Harmsen
H. J. M.

Raangs
G. C.

et al. (

1998

)

variationer av bakteriepopulationer i mänsklig avföring mätt med fluorescerande in situ hybridisering med gruppspecifika 16S rRNA-riktade oligonukleotidprober

.

Appl. Ungefär. Mikrobiol.
64

,

3336

3345

.

Neeser
J. R.

Golliard
M.

Woltz
A.
rouvet
M.
Dillmann
M. L.

Guggenheim
B.

(

1994

)

i vitro-modulator för oral bakteriell vidhäftning till salivbelagda hydroxypatitpärlor med mjölkkaseinderivat

.

Oral Mikrobiol. Immunol.
9

,

193

201

.

Wold
A. E.

Adlerberth
I.

(

2000

)

amning och tarmmikroflora hos spädbarnet-konsekvenser för skydd mot infektionssjukdomar

. I:

kort-och långtidseffekter av amning på barns hälsa

(

Keletzo
B.

et al. , EDS.).

Kluwer Academic / Plenum Publishers

,

New York

.

Pelligrini
A.

Thomas
U.

Bramaz
N.

Hunziker
P.

von Fellenberg
R.

(

1999

)

isolering och identifiering av tre bakteriedödande domäner i encefalopati alfa-laktalbuminmolekylen

.

Biochim. Biophys. Acta
1426

,

439

448

.

Siigur
U.

Ormission
A.

Tamm
A.

(

1993

)

fekala kortkedjiga fettsyror hos ammade och flaskmatade spädbarn

.

Acta Paediatr.
82

,

536

538

.

Wolin
M. J.

Yerry
S.

Miller
TL

Zhang
Y.

Bank
S.

(

1998

)

förändringar i produktionen av etanol, syror och H2 från glukos genom fekalfloran hos det 16 – till 158 dagar gamla ammade spädbarnet

.

J. Nutr.
128

,

85

90

.

Rasic
J. L.

Kurmann
J. A.

(

1983

)

bifidobakterier och deras roll

.

Birkhauser Verlag

,

Basel

.

Tianan
J.

Savaiano
D. A.

(

1997

)

redigering av kolonfermentering av bifidobakterier och pH in vitro

.

gräva. Tio. Sci.
42

,

2370

2377

.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.