utilizarea culturii lot și a unui sistem de cultură continuă în două etape pentru a studia efectul suplimentelor de lactalbumină și glicomacropeptidă pe populații mixte de bacterii intestinale umane

rezumat

anumiți factori de lapte pot promova creșterea unei microflore gastrointestinale prietenoase cu gazda. Acest lucru poate explica de ce sugarii alăptați au mai puține infecții intestinale decât omologii lor hrăniți cu formula. Efectul suplimentării cu formulă cu doi astfel de factori a fost investigat în acest studiu. Probele de fecale pentru sugari au fost utilizate pentru fermentarea formulelor suplimentate cu glicomacropeptidă și lactalbumină-lactalbumină într-un model de cultură continuă compusă în două etape. Bacteriologia a fost determinată prin hibridizare fluorescentă in situ. Vasele care conțineau lapte matern, precum și lactalbumina și glicomacropeptida au avut un număr stabil de bifidobacterii, în timp ce lactobacilii au crescut semnificativ numai în vasele cu lapte matern. Bacteroides, clostridia și Escherichia coli au scăzut semnificativ în toate alergările. Acetat a fost acidul principal găsit împreună cu cantități mari de propionat și lactat. Suplimentarea formulelor pentru sugari cu proteine din lapte adecvate poate fi utilă în simularea efectelor bacteriologice benefice ale laptelui matern.

1 Introducere

intestinul gros uman este un ecosistem complex care adăpostește o gamă largă de bacterii. Cel puțin 400 de specii bacteriene diferite sunt considerate a fi prezente în orice moment, cu până la 1012 bacterii găsite pe g de fecale . Microflora este dobândită la naștere, nou-născutul steril fiind colonizat de diverse bacterii în timpul procesului de naștere . În primele câteva zile de viață, predomină procariotele nedemontabile din punct de vedere nutrițional, cum ar fi enterobacteriile, stafilococii și streptococii (inclusiv enterococii). În prima săptămână de viață, se stabilesc genuri precum bifidobacterii și bacteroide . Se crede că sugarii alăptați au o floră colonică dominată numeric de bifidobacterii, în timp ce cei care sunt hrăniți cu formula au o microbiotă mai complexă, care are o compoziție similară cu cea a adulților . Bifidobacteriile pot exercita efecte antimicrobiene puternice împotriva unei varietăți de agenți patogeni intestinali, cum ar fi anumite Enterobacteriaceae și Clostridium spp. Ca atare, o predominanță a bifidobacteriilor este văzută ca un indicator al sănătății intestinale îmbunătățite . Observațiile asupra microflorei intestinale normale au fost în mare parte derivate din cultura cantitativă a plăcilor și caracterizarea fenotipică, care au limitări în ceea ce privește eficiența recuperării și subiectivitatea operatorului .mai mult, deoarece colonul proximal este inaccesibil din punct de vedere fizic în scopuri de rutină, majoritatea studiilor microbiene privind fermentația au fost efectuate cu bacterii fecale fie în culturi de lot, fie în chimiostatice cu o singură etapă . Cultura lotului permite determinarea fermentabilității diferitelor substraturi în perioade scurte (24 h). Cu toate acestea, există diferențe marcate în ceea ce privește disponibilitatea substratului și condițiile de mediu între colonul proximal și distal, care nu pot fi simulate într-un sistem cu un singur vas .

în schimb, sistemele in vitro care utilizează vase de fermentație multiple aliniate în serie au avantaje prin faptul că sunt capabile să modeleze condiții de mediu mai complexe, permițând în același timp eterogenitatea spațială și temporală . De exemplu, un chemostat în două etape cu reciclare celulară de la a doua la prima etapă s-a dovedit a produce rezultate satisfăcătoare . Rafinamentul suplimentar pentru modelarea colonului uman adult a fost realizat de Macfarlane și colab. folosind un sistem de cultură continuă compus în trei etape. Acest lucru a fost validat microbiologic împotriva materialului colonic uman obținut de la victimele morții subite la autopsie. Astfel de modele sunt valoroase pentru studierea microflorei intestinale, deoarece pot fi controlate diferite condiții fizico-chimice. Acest lucru are avantaje economice clare, dar este deosebit de relevant pentru planificarea studiilor umane.

diferențele în flora fecală sunt, de asemenea, reflectate în lactatul variabil, modelele de acizi grași cu catenă scurtă (SCFA) și cu catenă ramificată, care sunt produse intermediare și finale ale fermentației bacteriene . Rata lor de producție și modelul de fermentare pot fi, de asemenea, determinate de disponibilitatea substratului pentru flora bacteriană intestinală . Prin urmare, schimbările în flora fecală de la o modificare a dietei sau a terapiei antimicrobiene pot aduce, de asemenea, o modificare a modelelor de fermentare și a concentrației de acid organic . Cantitatea de astfel de acizi produsă la subiecții umani este dificil de determinat și au fost efectuate doar un număr mic de studii care indică faptul că la adulți se produc zilnic între 300 mmol și 1-2 mol de acid. S-a constatat că Acetatul este principalul SCFA produs în toate cazurile și dovezile sugerează că concentrațiile SCFA cecale sunt aproximativ duble față de cele din zona recto-sigmoidă .

două componente din lapte au demonstrat anterior că inhibă infecțiile gastro-intestinale și / sau stimulează bifidobacteriile in vitro. Glicomacropeptida (GMP), un derivat al cazeinei de la centi, a fost studiată extensiv in vitro și s-a demonstrat că inhibă aderența bacteriilor, virusurilor și toxinelor la membrana celulară prin legarea la situsurile receptorilor agentului patogen . Aceste teste in vitro au arătat, de asemenea, că GMP a promovat puternic creșterea Bifidobacterium breve, B. bifidum, B. infantis și Lactococcus lactis. s-a demonstrat că lactalbumina (la), care are o structură terțiară comparabilă cu lizozimele de tip c, are efecte similare . Pihlanto-Lepp al. anterior, s-a arătat că la-ul a redus activitatea metabolică a Escherichia coli JM103 la doar 21% din normal. În plus, testarea laptelui de vacă purificat a arătat că, pentru B. infantis și B. breve, produsul a fost un puternic promotor de creștere.

în acest studiu, am folosit cultura în lot și un sistem de cultură continuă compus în două etape pentru a testa proprietățile de fermentare și activitățile bacteriene în urma suplimentării furajelor cu formula pentru sugari cu centimetric și GMP. Sistemul de cultură continuă a fost adaptat din modelul în trei etape dezvoltat de Macfarlane și colab. . Volumul său de operare mai mic și ratele de rotație mai rapide au încercat să țină cont de factorii fizici găsiți la sugarii umani. Am testat dacă suplimentarea cu GMP poate modifica flora gastrointestinală pentru a oferi beneficii similare cu cele observate la sugarii alăptați.

2 Materiale și metode

2.1 cultură lot

pentru sistemele de cultură lot anaerobe, mediul de cultură bazală conținea (per litru): 1 g peptonă, 1 g extract de drojdie, 0,05 g NaCl, 0,02 g K2HPO4, 0,02 g KH2PO4, 0,005 g MgSO4·7H2O, 0,005 g CaCl2·6H2O, 1 g NaHCO3, 1 ml între 80, 0.0025 g hemină, 5 ukticl vitamina K1, 0,25 g cisteină HCl și 0,25 g săruri biliare dizolvate în 500 ml apă deionizată, ajustate la pH 7,0 și sterilizate prin autoclavare. Toate substanțele chimice au fost obținute de la Sigma (Poole, Dorset, Marea Britanie), cu excepția cazului în care se specifică altfel. Mediul steril (50 ml) a fost introdus în flacoane de cultură de 100 ml conținând 0,5 g (1% m/v) dintr-o formulă de testare (Arla Foods Ingredients, Viby, Danemarca) suplimentată fie cu produsul (68% m/v), fie cu produsul GMP (80% M/v) și menținută sub o atmosferă de azot gazos fără oxigen. Formulele au fost comparate cu un standard care conține 1% (g/g) lactoză. A doua zi, o probă de fecale proaspete a fost colectată într-o pungă stomacher și procesată imediat. Experimentul a fost repetat de cinci ori folosind cinci donatori diferiți.

vasele de cultură ale lotului au fost inoculate cu 5 ml suspensie fecală de 10% (m / v) de la voluntari adulți sănătoși, preparată cu soluție salină tamponată cu fosfat anaerob (PBS, 0,1 M, pH 7,2), iar probele de 1 ml au fost prelevate la orele 0 (înainte de introducerea probei în cultura lotului), 6 ore și 24 ore și depozitate la 4 centimetrii C până la utilizarea ulterioară. Pentru numărarea bacteriilor prin hibridizare fluorescentă in situ (pește), s-au îndepărtat 375-unkticli triplicați din proba colectată și s-au adăugat într-un tub Eppendorf de 1,5 ml conținând 1125 unkticli de paraformaldehidă sterilizată cu filtru 4% (g/v) în PBS (pH 7,2) și s-a fixat timp de cel puțin 4 ore la 4 oktib C. eșantionul fix a fost apoi centrifugat timp de 5 min la 13 000 oktib g și supernatantul a fost aruncat. Peleta a fost omogenizată în 1 ml de PBS filtrat (pH 7,4) conținând 0,00001% (g/v) bromură de cetil trimetil amoniu și transferată într-un tub Eppendorf pentru repelentare (13 000 g, 5 min). După spălarea peletei a doua oară, supernatantul a fost îndepărtat și peleta a fost resuspendată temeinic în 150 ilqq de PBS filtrat și 150 ilqq de etanol 96% (v/v). Eșantionul a fost amestecat bine și depozitat la -20 centimetric C timp de cel puțin 1 oră înainte de hibridizare cu o sondă fluorescentă (așa cum este descris mai jos).

2.2 sistem de cultură continuă în două etape

sistemul de cultură continuă a constat din două vase de sticlă, V1 și V2, ambele cu un volum de funcționare de 100 ml. Temperatura (37 C) și pH-ul au fost controlate automat. PH-ul culturii în vase a fost de 5.2 în V1, reprezentând mediul cu pH scăzut al colonului proximal și 6,5 în V2, indicativ al unui pH mai neutru în colonul distal. Fiecare fermentator a fost agitat magnetic și mediul de creștere a fost spart continuu cu azot fără oxigen (15 ml min-1) și alimentat dintr−un rezervor mediu de sticlă de către o pompă peristaltică (Watson-Marlow, Falmouth, Marea Britanie) la V1. V1 a furnizat secvențial V2 printr-un preaplin și o serie de diguri. Revărsarea de la V2 a fost condusă la un recipient pentru deșeuri. Mediul de cultură a constat din (A) mediul bazal descris mai sus cu 1% (g/v) lactoză adăugată (Sigma, Poole, Dorset, Marea Britanie), (B) lapte matern uman (furnizat de Royal Berkshire Hospital, Reading, Marea Britanie) cu 0,5 g l−1L-cisteină-HCl adăugată, (C) formula de testare cu 68% (g/v) suplimentarecinct-la, 1% (g/v) lactoză și 0,5 g l−1L-cisteină-HCl și (D) formula de testare cu 68% (g/v) g/v) GMP, 1% (g / v) lactoză și 0,5 g l−1l-cisteină-HCL. Toate formulele au fost obținute din ingrediente Arla Foods (Viby, Danemarca) și predigerate folosind pepsină (575 U per g proteină) la pH 2 timp de 2 ore (37 u XC), urmată de pancreatină (50 u per g proteină) și 0,5 g L−1 volum acid biliar la pH 6,5 timp de două ore (37 u XC). Pentru a asigura anaerobicitatea, 4 ml l−1 dintr-o soluție stoc de resazurin de 250 mg L-1 au fost fierte și adăugate în mediu. Mediile au fost apoi încălzite la 80 centimetric C timp de 20 min, răcite la temperatura camerei peste noapte și încălzite la 80 centimetric C timp de încă 20 min înainte de a fi sparte continuu cu N2 fără O2. Sistemul a fost operat la un timp de retenție (R) de 12 ore, calculat ca reciprocitatea vitezei de diluare. Timpul de retenție a sistemului a constituit suma valorilor r individuale în fiecare fermentator. Fiecare fermentator a fost inoculat cu 15 ml dintr-o suspensie fecală proaspătă de 10% (m/v) de la donatori sănătoși pentru sugari cu vârsta cuprinsă între 1 și 6 luni și a fost hrănit cu lapte matern cu formulă suplimentară. Suspensia a fost preparată folosind anaerob 0,1 m PBS (pH 7,2). Toate experimentele au fost repetate de cinci ori folosind donatori diferiți, cu excepția grupului B (laptele matern), unde experimentul a fost efectuat o dată folosind materialul fecal al unui donator în vârstă de 3 luni, alăptat exclusiv. Grupurile C și D conțineau fiecare cinci indivizi diferiți. Probele au fost prelevate după vârsta de 1, 3 și 6 luni pentru a evalua orice diferențe în microflora fecală și orice modificări ale eficacității suplimentelor pe măsură ce sugarii au ajuns la maturitate. Sistemul de fermentare a fost lăsat să se echilibreze peste noapte înainte de pornirea pompei de mediu și a fost rulat timp de cel puțin 144 de ore pentru a stabili condiții la starea de echilibru. S-au prelevat probe de 3 ml din inoculul original (N), după echilibrare (T0) și în condiții de echilibru (ST) și s-au pregătit pentru analiza peștilor, conform descrierii de mai sus.

2.3 enumerarea bacteriilor prin pești

probe oligonucleotidice (Tabelul 1) Pentru Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp./ Enterococcus, Bacteroides spp. , Grupul Clostridium histolyticum și E. coli au fost sintetizate și monomarcate la capătul 5′ cu Cy3 (Ex 552 nm, Em 568 nm) fie de Eurogentec (Abingdon, MAREA BRITANIE), fie de MWG-Biotech (Milton Keynes, Marea Britanie). Hibridizarea s-a efectuat peste noapte la 50% C pentru Bifidobacterium și Clostridium, la 45% C pentru Lactobacillus și Bacteroides și la 37% C pentru E. coli. Pentru hibridizare, s–au adăugat 200 unktl de tampon filtrat (40 mM Tris−HCl pH 7,2, 1,8 M naci) conținând 20 ml l-1 de 10% (g/v) SDS și 64 unktl de apă de calitate HPLC la 16 unktl de celule fixe și s-au încălzit la temperatura corespunzătoare. S−a adăugat soluția de hibridizare pre-încălzită (90 ilft) la 10 ilft din sonda corespunzătoare (concentrație finală 50 ng ilftt-1) și soluția a fost incubată peste noapte într-un cuptor de hibridizare. Pentru sonda E. coli, s-au adăugat 264 unqq de tampon de hibridizare conținând 35% (v/v) de formamidă la 16 unqq de celule fixe. Celulele au fost spălate prin adăugarea a 5 ml tampon de spălare (20 mM Tris–HCl pH 7,2, 0,9 m naci) la 5-100 oktl de probă hibridizată, colorată cu 20 oktl 4′,6-diamidino-2-fenilindol (Dapi, Ex 344, Em 450; 500 ng ml−1) și incubată într-un cuptor de hibridizare timp de 30 min. Pentru numărul total, 5-12 unqq de probă a fost filtrată în vid pe un filtru de policarbonat de 0,2-unqqm (Millipore, Watford, Marea Britanie) și plasată pe o lamelă de microscop. Pentru a evita decolorarea sondelor, la filtru a fost adăugată o picătură de componentă a kitului Antifade SlowFade-Light (Molecular sonde Europe, Leiden, Olanda). Diapozitivele au fost examinate microscopic folosind un atașament EPI-fluorescență (Nikon MAREA BRITANIE, Kingston upon Thames, Marea Britanie). Lumina UV a fost utilizată pentru a număra bacteriile colorate de Dapi, iar celulele colorate de Cy3 au fost enumerate la 550 nm. Cincisprezece câmpuri aleatorii cu o bună distribuție a celulelor (10-100) au fost numărate pentru fiecare sondă și probă.

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

2.4 Volatile acid analysis

Undiluted aliquots (1.0 ml) din eșantion au fost distribuite în tuburi Eppendorf de 1,5 ml și centrifugate (13 000 g, 5 min) la bacterii pelete și alte solide. Supernatantul a fost apoi filtrat folosind un filtru din policarbonat de 0,2−centimm și adăugat la patru părți acetonitril conținând 4,3 mmol L-1 de acid 2-etilbutiric ca standard intern. Calibrarea s-a făcut folosind soluții standard de acid acetic, acid propionic, acid i-butiric, acid N-butiric, acid i-valeric, acid N-valeric, acid N-caproic și acid dl-lactic în acetonitril. Acizii grași au fost determinați prin cromatografie gaz–lichid pe un sistem GC din seria Agilent 6890 (Agilent, Waldbronn, Germania) echipat cu o coloană Optima ffap (25 m 0,32 mm, Macherey-Nagel, D Oustren, Germania) și un detector de ionizare a flăcării. Heliul gazos purtător a fost livrat la un debit de 1,8 ml min-1. Injectorul, coloana și detectorul au fost setate la 220 CTC, 140 CTC (Izotermă) și, respectiv, 220 CTC. După 5 min, Temperatura coloanei a fost mărită la 240 de Centimetre C la 20 de Centimetre c min−1 pentru a funcționa încă 15 min. Peaks au fost integrate folosind un PC care rulează software-ul de gestionare Atlas Lab (Thermo Lab Systems, Mainz, Germania). Concentrațiile de acizi grași au fost calculate prin compararea zonelor lor maxime cu cele ale standardului intern și au fost exprimate în milimoli pe litru.

2.5 analiza statistică

analiza statistică a fost efectuată utilizând ANOVA unidirecțională (inoculum, versus starea de echilibru, TS) pentru determinarea semnificației la P<0.05 dacă nu se specifică altfel.

3 rezultate

3.1 lot de cultură

înainte de inoculare, probele conțineau un număr aproape identic de Bifidobacterium spp., Bacteroides spp., și Clostridium spp. Lactobacilii au fost mai puțin numeroși. În culturile care conțin sec-la (Fig. 1), Numărul total, bifidobacteriile, clostridia, lactobacilii și bacteroidele au rămas neschimbate. Numărul de E. coli a scăzut semnificativ (P<0,01) cu suplimentarea cu LA-LA după 6 ore de incubare, dar a crescut din nou la nivelurile inițiale (nu este prezentat).

1

numărul mediu de bacterii (log10) în inoculul fecal adult și în culturile de loturi conținând mediu bazal cu 1% (g/g) lactoză) sau 1% (g / g) formulă de testare. Rezultatele sunt mijloace (log10 per g greutate umeda) S. D. n=inocul fecal; 24 h, lactoza=cultura dupa 24 h de incubatie continand lactoza; 24 h, A-la/GMP=cultura dupa 24 h de incubatie continand lactoza-la sau GMP.

1

numărul mediu de bacterii (log10) în inoculul fecal adult și în culturile loturilor conținând mediu bazal cu 1% (g/g) lactoză) sau 1% (g / g) formulă de testare. Rezultatele sunt mijloace (log10 per g greutate umeda) S. D. n=inocul fecal; 24 h, lactoza=cultura dupa 24 h de incubatie continand lactoza; 24 h, A-la/GMP=cultura dupa 24 h de incubatie continand lactoza-la sau GMP.

culturi care conțin GMP (Fig. 1) menținut în general un număr de bifidobacterii, Bacteroides, lactobacili și clostridia. Numărul de E. coli a scăzut semnificativ (P<0,05) după 6 ore de incubație, dar, din nou, a crescut la nivelurile bazale (nu este prezentat).

3.2 Sistem de cultură continuă compus în două etape

în vase care conțin același mediu standard (mediu bazal care conține 1% g/g lactoză, Fig. 2), Numărul total de bacterii, bifidobacterii, lactobacili și clostridia au rămas constante. În schimb, bacteroidele au crescut semnificativ în ambele vase de fermentație după echilibru și au rămas mai mari decât nivelurile de inocul la starea de echilibru în ambele vase (P<0,05). O scădere semnificativă statistic (P<0,05) a putut fi observată pentru E. coli în vasul 2 (pH 6,5) după echilibrare. Cu toate acestea, acest lucru nu a fost menținut și ambele vase au avut niveluri comparabile de E. coli la starea de echilibru, care au fost mai mici decât inoculul.

2

numărul mediu de bacterii (log10) în inoculul fecal și în vasele fermentatorului martor cu mediu bazal conținând 1% (g / g) lactoză sau lapte matern (BM). Rezultatele sunt mijloace (log10 per g greutate umedă) S. D. n=inocul fecal; V1TS=vasul 1 la starea de echilibru (pH 5,2); V2TS=vasul 2 la starea de echilibru (pH 6,5).

2

numărul mediu de bacterii (log10) în inoculul fecal și în vasele fermentatorului martor cu mediu bazal conținând 1% (g / g) lactoză sau lapte matern (BM). Rezultatele sunt mijloace (log10 per g greutate umedă) S. D. n=inocul fecal; V1TS=vasul 1 la starea de echilibru (pH 5,2); V2TS=vasul 2 la starea de echilibru (pH 6,5).

după vasele care conțin lapte matern (Fig. 2) au fost lăsate să se echilibreze timp de 24 de ore, o creștere semnificativă statistic (P<0,05) a fost observată pentru lactobacili în vasul 2 (pH 6.5), care a fost reținut până la atingerea stării de echilibru. Numărul de bifidobacterii a rămas stabil. În schimb, clostridia a scăzut semnificativ (P<0,01) în ambele vase și a dispărut complet din vasul 1 (pH 5,2) la starea de echilibru. Scăderi similare (P<0,05) au fost observate pentru E. coli în vasul 1 (pH 5,2), dar nu și în vasul 2 (pH 6,5). Vasele care conțineau un număr de bacterii de 1 și 3 luni și care au fost inoculate cu probe fecale obținute de la sugari cu vârsta de 1 și 3 luni au avut un număr total stabil, precum și niveluri de alte bacterii (nu au fost prezentate). Când fermentatorii au fost inoculați cu probe fecale obținute de la sugari de 6 luni (Fig. 3), numărul total și numărul de lactobacili au rămas neschimbate. Numărul de bacteroizi, clostridii și E. coli a scăzut considerabil după echilibrare și s-a observat o reducere semnificativă statistic (P<0, 05) la ambele niveluri de pH. Navele care conțin GMP și inoculate cu probe fecale de la sugari cu vârsta de 1 și 3 luni au avut număr total de bacteroizi și E. coli care au fluctuat, dar au rămas stabile. Așa cum s-a observat în cazul consumului de lactobacili, lactobacilii au prezentat o ușoară tendință ascendentă în comparație cu probele inițiale, dar semnificația statistică nu a fost observată (nu a fost prezentată). Când fermentatorii au fost inoculați cu fecale de la sugari de 6 luni (Fig. 3), numărul total, lactobacilii și bifidobacteriile au rămas neschimbate. Numărul de bacteroizi, clostridium și E. coli a scăzut considerabil după echilibru și s-a observat o reducere semnificativă statistic (P<0,05), similară cu cea observată la formula suplimentată cu un număr de la-la-uri, la ambele niveluri de pH.

3

numărul mediu de bacterii în vasele de inocul și fermentator (log10) care conțin la sau GMP, utilizând materiile fecale ale donatorilor în vârstă de 6 luni. Rezultatele sunt mijloace (log10 per g greutate umedă) S. D. n=inocul fecal; V1TS=vasul 1 la starea de echilibru (pH 5,2); V2TS=vasul 2 la starea de echilibru (pH 6,5).

3

numărul mediu de bacterii în vasele de inocul și fermentator (log10) care conțin la sau GMP, utilizând materiile fecale ale donatorilor în vârstă de 6 luni. Rezultatele sunt mijloace (log10 per g greutate umedă) S. D. n=inocul fecal; V1TS=vasul 1 la starea de echilibru (pH 5,2); V2TS = vasul 2 la starea de echilibru (pH 6,5).

3,3 acizi organici

cantitățile totale de acizi organici au variat semnificativ statistic (P<0,05) între inoculă și timpii de probă, media acidului total pentru inoculă fiind de 4,28 mmol l−1, 8,16 mmol l−1 și 15,64 mmol l−1 comparativ cu 73,80 mmol/l−1 (interval 18,93–160,49), 39,29 mmol l−1 (interval 15,30–100,28) și 80,49 mmol L−1 (interval 28,07–177,34) pentru donatorii în vârstă de 1, 3 și respectiv 6 luni. Erorile Standard au fost 4.96%, 3.10%, 2.61%, 1.80%, 0.91%, 0.84%, 1.91% și 5.12% pentru acetat, propionat, i-butirat, n-butirat, i-valerat, n-valerat, caproat și, respectiv, lactat. Acetat a fost acidul predominant în toate grupele (Fig. 4) urmat de lactat și propionat, în medie 63%, 21%, respectiv 11% din acidul total. d (-) – lactatul a fost găsit predominant în comparație cu L (+) – lactatul care a apărut doar sporadic și în cantități minime. Nu s-au constatat diferențe semnificative statistic între grupurile de studiu pentru izoacizi, valerat și caproat, care au apărut în cantități mici.

4

cantități relative medii (%) de acid în vasele de fermentare. Diete: n = inocul; a-la (La-La) = La-lactalbumină; GMP = glicomacropeptidă; BM=laptele matern. Vârsta donatorului: 1=1 lună; 3=3 luni; 6 = 6 luni după naștere.

4

cantități relative medii (%) de acid în vasele de fermentare. Diete: n = inocul; a-la (La-La) = La-lactalbumină; GMP = glicomacropeptidă; BM=laptele matern. Vârsta donatorului: 1=1 lună; 3=3 luni; 6 = 6 luni după naștere.

a existat totuși o diferență semnificativă statistic (P<0.05) între grupuri pentru cantitățile relative ale acizilor majori și n-butirat. Acetatul și lactatul au apărut în general într-un raport de 3:2, cu excepția inoculului sugarilor în vârstă de 6 luni, unde a predominat lactatul (P<0,01). concentrațiile de N-butirat au crescut în general odată cu vârsta donatorului, în timp ce propionatul a scăzut până când ambele au fost aproximativ egale în concentrație. Cantități mici de I-butirat au fost, de asemenea, găsite în toate grupele de vârstă donatoare, precum și în grupul de lapte matern.

4 discuție

pe baza studiilor anterioare, se crede în general că sugarii alăptați pot beneficia de microbiota dominată numeric de bifidobacterii și / sau lactobacili . anterior, s-a constatat că in vitro s-au stimulat în mod semnificativ culturile pure selectate de bifidobacterii. Cu toate acestea, rezultate similare nu au fost observate aici în cultura mixtă. În culturile loturilor preliminare inoculate cu materii fecale adulte, nu s-a observat niciun efect semnificativ statistic asupra microflorei benefice. Același lucru a fost valabil și pentru ambele suplimente atunci când sunt utilizate în cultura continuă inoculată cu material fecal de la sugari de diferite grupe de vârstă. În ciuda acestui fapt, bifidobacteriile au fost grupul dominant atât în formulele de testare, cât și în controlul laptelui matern, unde bifidobacteriile au rămas constante pe tot parcursul experimentului. Un efect mai profund a fost observat pentru lactobacili. Laptele matern a crescut semnificativ lactobacilii. O creștere minoră, dar nesemnificativă statistic a numărului de lactobacili a fost demonstrată cu GMP în fecalele sugarilor în vârstă de 3 luni, tendință care a continuat în experimentele care au utilizat material fecal la sugarii în vârstă de 6 luni.ambele suplimente cu formula sunt, de asemenea, considerate a avea un efect inhibitor asupra unei varietăți de agenți patogeni. GMP s-a dovedit anterior că are mai multe atribute anti-patogene atât în lanțul său de carbohidrați care conține acid N-acetilneuraminic (acid sialic), cât și în porțiunea sa polipeptidică . Prezența acizilor sialici pe suprafața celulelor intestinale este adesea necesară pentru infecția unei varietăți de agenți patogeni enterici și o sursă exogenă de GMP ar putea inhiba aderența bacteriană, care este esențială pentru infecție. Acest lucru a fost demonstrat de Kawakami prin inhibarea aderenței E. coli enteropatogene la liniile celulare intestinale umane. În general, concentrația componentelor care conțin acid sialic este mai mare în laptele uman decât în formulele pentru sugari. Un efect inhibitor al GMP asupra Bacteroides, clostridia și E. coli, trei organisme potențial patogene, a fost observată în acest studiu. În timp ce în culturile de loturi preliminare care utilizează materii fecale adulte, numărul de materii fecale a fost în general conservat, s-a observat o tendință descendentă în cultura continuă. Cu toate acestea, o reducere semnificativă statistic a acestor organisme a fost detectată numai în culturile care utilizează materii fecale la sugari în vârstă de 6 luni. Rezultate similare au fost observate în laptele matern, care a scăzut semnificativ clostridia și E. coli, în timp ce bacteroidele au rămas neschimbate. În schimb, mediul bazal a crescut semnificativ nivelurile de bacteroizi, arătând că modificările compoziției florei nu au fost rezultatul spălării, ci au depins de mediul de fermentație.

-la, o componentă reglatoare a lactozei sintază, împărtășește un nivel ridicat de identitate a secvenței la lizozimele de tip c și are o structură tridimensională similară sugerând că provin dintr-o genă ancestrală comună . S-au efectuat mai multe studii pentru a sugera că acest produs ar putea avea efecte similare asupra agenților patogeni . În schimb, Pelligrini și colab. s-a constatat că digestia proteolitică prin tripsină și pepsină a dat trei peptide cu proprietăți bactericide, în mare parte active împotriva organismelor Gram-negative. Proprietățile bacteriostatice ale hidrolizatului-la au fost observate special pentru E. coli. În acest studiu s-a observat un efect inhibitor al tratamentului cu lactox-la asupra Bacteroidelor, clostridiilor și E. coli. Din nou, o reducere semnificativă statistic a acestor organisme a fost detectată doar în culturile care rulează materii fecale la sugari în vârstă de 6 luni, un rezultat comparabil cu cel obținut pentru controalele laptelui matern.

studiul nostru a confirmat că acetatul a fost principalul SCFA la sugarii alăptați în comparație cu sugarii hrăniți cu biberonul, împreună cu concentrații scăzute de propionat și o absență aproape totală de butirat în primele 117 zile de viață . Lactatul și acetatul au apărut în general într-un raport de 2:3, ceea ce confirmă rolul predominant al bifidobacteriilor în microflora așa cum este descris de Rasic și Kurmann . O incidență ridicată a lactatului este, de asemenea, tipică pentru fermentarea incompletă sau rapidă asociată în mod obișnuit cu un pH acid, așa cum se observă la bebelușii alăptați . Cu toate acestea, acest lucru nu a fost confirmat aici, deoarece inoculul fecal al donatorilor alăptați care fermentează laptele matern a produs un profil acid aproape complet lipsit de lactat. Pe de altă parte, exemplarele fecale care fermentează formula suplimentată cu formula de la-la – și GMP au produs un profil acid caracteristic fermentației cu formula cu concentrații mai mari de n-butirat, care a crescut odată cu vârsta donatorului . Cu toate acestea, acetatul a rămas în continuare predominant, așa cum se observă la sugarii alăptați exclusiv.

în rezumat, am arătat efectele microbiologice ale suplimentării formulelor pentru sugari cu XV-la și GMP. Comparativ cu studiile anterioare in vitro folosind culturi pure de bifidobacterii, nu a fost observat un efect bifidogen al celor două suplimente folosind inocula fecală. Cu toate acestea, s-a observat o reducere semnificativă statistic a microflorei potențial patogene, care a fost similară cu cea observată la sugarii alăptați. Astfel, în acest context, se poate concluziona că suplimentarea cu oxi-la și GMP în combinație cu cantități mari de acetat are efecte benefice asupra microflorei umane.

mulțumiri

cercetătorii ar dori să mulțumească Doamnei Alethea Hill, precum și donatorilor și părinților lor pentru sprijinul, entuziasmul și ajutorul neprețuit pentru studiu.

Borriello
S. P.

(

1986

)

flora microbiană a tractului gastro-intestinal

. În:

metabolismul microbian în tractul digestiv

(

Hill
M. J.

, Ed.), pp.

2

16

.

CRC Press

,

Boca Raton, FL

.

din Sonnenborn
Stobernack
H.-P.

Proppert
Y.

(

1990

)

dezvoltarea florei intestinale anaerobe la nou-născuți

.

progres. Med.
108

,

420

424

.

Mitsuoka

(

1995

)

Ecologie microbiană intestinală comparativă și metabolism la om și animale

. În:

Aspecte medicale și dentare ale anaerobilor

(

Duerden
B. I.

Wade
W. G.
Brazier
J. S.
Eley
A.

Wren
B.
Hudson
M. J

, EDS.), pp.

87

107

.

recenzii științifice

.

Harmsen
H. J. M.

Wildeboer-Veloo
A. C. M.
Raangs
G. C.

și colab. (

2000

)

analiza dezvoltării florei intestinale la sugarii alăptați și hrăniți cu formula prin utilizarea metodelor de identificare și detectare moleculară

.

J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr.
30

,

61

67

.

Salminen
Bouley
Boutron-Ruault
M.-C.

și colab. (

1998

)

știința alimentară funcțională și fiziologia și funcția gastrointestinală

.

Br. J. Nutr.
80

,

S147

S171

.

Harmsen
H. J. M.

Gibson
G. R.

și colab. (

1999

)

compararea numărului de celule funcționale și hibridizarea fluorescenței in situ folosind sonde specifice pe bază de ARNr pentru cuantificarea bacteriilor fecale umane

.

Microbiol FEMS. Let.
183

,

125

129

.

Macfarlane
G. T.

Gibson
G. R.

Macfarlane
S.

(

1994

)

producția de acizi grași cu lanț scurt și lactat de către bacteriile intestinale umane cultivate în lot și cultură continuă

. În:

acizi grași cu lanț scurt

(

Binder
H. J.

Cummings
J. H.

Soergel
K. H.

, Eds.), pp.

44

60

.

Kluwer Publishing

,

Londra

.

Allison
McFarlan
C.

Macfarlane
G. T.

(

1989

)

studii asupra populațiilor mixte de bacterii intestinale umane cultivate în sisteme de cultură continuă unică și multietajată

.

Appl. Aprox. Microbiol.
55

,

679

683

.

Marsh
P.

(

1995

)

rolul culturii continue în modelarea microflorei umane

.

J. Chem. Tech. Biotehnol.
64

,

1

9

.

Veilleux
B. G.

Rowland
I.

(

1981

)

simularea intestinului de șobolan ecosistem folosind un sistem de cultură continuă în două etape

.

J. gen.Microbiol.
123

,

103

115

.

Macfarlane
G. T.
Macfarlane
S.

Gibson
G. R.

(

1998

)

validarea unui sistem de cultură continuă compus în trei etape pentru investigarea efectului timpului de retenție asupra ecologiei și metabolismului bacteriilor din colonul uman

.

Microb. Ecol.
35

,

180

187

.

Edwards
C. A.

Parrett
A. M.

Balmer
S. E.
Wharton
B. A.

(

1994

)

acizi grași cu catenă scurtă fecală la bebelușii alăptați și hrăniți cu formulă

. Acta Paediatr.

83

,

459

462

.

Cummings

(

1983

)

fermentarea în intestinul gros uman: dovezi și implicații pentru sănătate

.

Lancet
1

,

1206

1208

.

Midtvedt
T.
Carlstedt-Duke
B.

H T.

și colab. (

1986

)

influența antimicrobianului peroral asupra activității biotransformatoare a microflorei intestinale la subiectul sănătos

.

Eur. J. Blink. Investește.
16

,

11

17

.

Kawakami
H.

(

1997

)

Biological significance of sialic acid-containing substances in milk and their application

.

Recent Res. Dev. Agric. Biol. Chem.
1

,

193

207

.

Idota
T.

Kawakami
H.

Nakajima
I.

(

1994

)

Growth-promoting effects of N-actelylneuraminic acid containing substances on bifidobacteria

.

Biosci. Biotechnol. Biochem.
58

,

1720

1722

.

Bouhallab
Favrot
Maubois
J. L.

(

1993

)

activitatea de promovare a creșterii digestiei Triptice a cazeinomacropeptidei pentru Lactococcus Lactis ssp. lactis

.

lapte
73

,

73

77

.

Xue
Lui
J. N.

Sun
Z.
Mat
Z.
Wu
C.
Zhu
D.

(

2001

)

mutant al Lactalbuminei care acționează ca lizozim

.

proteine Struct. Funct. Genet.
42

,

17

22

.

Pihlanto-Lapp Unktifl
A.

Marnila
P.

Hubert
L.

Rokka
T.

Korhonen
H. J. T.
carpian
M.

(

1999

)

efectul hidrosilaților de lactalbumină și de lactalbumină asupra activității metabolice a Escherichia coli jm103

.

J. Appl. Microbiol.
87

,

540

545

.

Petschow
B. W.
Talbott
D.

(

1991

)

răspunsul specii Bifidobacterium la promotori de creștere în laptele uman și de vacă

.

Pediatr. Res.
29

,

208

213

.

Franks
A. H.
Harmsen
H. J. M.

Raangs
G. C.

și colab. (

1998

)

variații ale populațiilor bacteriene din fecalele umane măsurate prin hibridizare fluorescentă in situ cu sonde oligonucleotidice specifice grupului 16S rRNA

.

Appl. Aprox. Microbiol.
64

,

3336

3345

.

Neeser
J. R.
Golliard
M.

Woltz
A.
rouvet
M.
Dillmann
M. L.

Guggenheim
B.

(

1994

)

în modulator vitro al aderenței bacteriene orale la margele hidroxipatite acoperite cu salivă de derivați de cazeină din lapte

. Microbiol Oral. Immunol.

9

,

193

201

.

Wold
A. E.

Adlerberth
I.

(

2000

)

alăptarea și microflora intestinală a sugarului-implicații pentru protecția împotriva bolilor infecțioase

. În:

efectele pe termen scurt și lung ale alăptării asupra sănătății copilului

(

Keletzo
B.

și colab. , Eds.).

Kluwer Academic/Plenum Publishers

,

New York

.

Pelligrini
A.

Thomas
U.
Bramaz
N.
Hunziker
P.
von Fellenberg
R.

(

1999

)

izolarea și identificarea a trei domenii bactericide în molecula encefalopatiei alfa-lactalbumină

.

Biochim. Biophys. Acta
1426

,

439

448

.

Siigur

Ormission
A.

Tamm
A.

(

1993

)

acizi grași fecali cu catenă scurtă la sugarii alăptați și hrăniți cu biberonul

. Acta Paediatr.

82

,

536

538

.

Wolin
Yerry
S.
Miller
T. L.
Zhang
Y.
Banca
S.

(

1998

)

modificări ale producției de etanol, acizi și H2 din glucoză de către flora fecală a sugarului alăptat în vârstă de 16 până la 158 de zile

.

J. Nutr.
128

,

85

90

.

Rasic
J. L.

Kurmann
J. A.

(

1983

)

bifidobacterii și rolul lor

.

Birkhauser Verlag

,

Basel

.

Tianan
J.

Savaiano
D. A.

(

1997

)

editarea fermentației colonului prin bifidobacterii și pH in vitro

. Dig. Zece. Sci.

42

,

2370

2377

.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.