Uso de lotes de cultura e um dois-fase contínua do sistema de cultura, para estudar o efeito de suplementar a α-lactalbumina e glycomacropeptide misto populações de humanos bactérias intestinais

Resumo

Certos leite fatores podem promover o crescimento de um host-friendly microflora gastrointestinal. Isto pode explicar por que razão as crianças amamentadas sofrem menos infecções intestinais do que as suas congéneres alimentadas a fórmula. O efeito da suplementação por fórmula com dois desses fatores foi investigado neste estudo. Amostras fecais para lactentes foram utilizadas para fertilizar fórmulas suplementadas com glicomacropeptídeo e α-lactalbumina num modelo de cultura contínua composta em duas fases. A bacteriologia foi determinada pela hibridização por fluorescência in situ. Os vasos que continham leite materno, bem como a α-lactalbumina e o glicomacropeptídeo apresentavam contagens estáveis de bifidobactérias, enquanto o lactobacilos aumentava significativamente apenas nos vasos com leite materno. Bacteroides, clostridia e Escherichia coli diminuíram significativamente em todas as corridas. O acetato foi o principal ácido encontrado junto com altas quantidades de propionato e lactato. A suplementação de fórmulas para lactentes com proteínas do leite adequadas pode ser útil para simular os efeitos bacteriológicos benéficos do leite materno.o intestino grosso do homem é um ecossistema complexo que alberga uma vasta gama de bactérias. Acredita-se que pelo menos 400 espécies bacterianas diferentes estejam presentes de uma só vez, com até 1012 bactérias encontradas por g de fezes . A microflora é adquirida no nascimento, com o recém-nascido esterilizado sendo colonizado por várias bactérias durante o processo de parto . Durante os primeiros dias de vida, proeminentes procariontes, como enterobacteria, estafilococos e estreptococos (incluindo enterococos), não marcam nutricionalmente. Na primeira semana de vida, gêneros como bifidobacteria e Bacteroides se estabelecem . Pensa-se que as crianças amamentadas têm uma flora colónica que é numericamente dominada por bifidobactérias, enquanto que as que são alimentadas com fórmulas têm microbiota mais complexa que é semelhante em composição às dos adultos . Bifidobacteria pode exercer poderosos efeitos antimicrobianos contra uma variedade de agentes patogénicos intestinais, tais como certas Enterobacteriaceae e Clostridium spp. Como tal, a predominância de bifidobactérias é vista como um indicador da melhoria da saúde intestinal . As observações sobre a microflora intestinal normal foram em grande parte derivadas da cultura quantitativa em placas e da caracterização fenotípica, que têm limitações em termos de eficiência de recuperação e subjectividade do operador .além disso, como o cólon proximal é fisicamente inacessível para fins de rotina, a maioria dos estudos microbianos sobre fermentação foram realizados com bactérias fecais em cultura de lote ou quimiostatos de estágio único . A cultura do lote permite determinar a fermentabilidade de vários substratos durante curtos períodos (24 h). No entanto, existem diferenças acentuadas na disponibilidade do substrato e nas condições ambientais entre o cólon proximal e distal, que não podem ser simuladas num único sistema de vasos .em contrapartida, os sistemas in vitro que utilizam recipientes de fermentação múltipla alinhados em série têm vantagens em ser capazes de modelar condições ambientais mais complexas, permitindo a heterogeneidade espacial e temporal . Por exemplo, um quimiostato em duas fases, com reciclagem de células da Segunda para a primeira fase, mostrou produzir resultados satisfatórios . Outro refinamento para modelar o cólon humano adulto foi realizado por Macfarlane et al. usando um sistema de cultura contínua composto de três estágios. Isto foi microbiologicamente validado com material colónico humano obtido de vítimas de morte súbita na autópsia. Tais modelos são valiosos para o estudo da microflora intestinal, uma vez que diferentes condições físico-químicas podem ser controladas. Isto tem claras vantagens econômicas, mas é especialmente relevante para o planejamento de estudos humanos.as diferenças na flora fecal reflectem – se também em diferentes padrões de lactato, ácidos gordos de cadeia curta e ramificada, que são produtos intermédios e finais da fermentação bacteriana . A sua taxa de produção e padrão de fermentação também podem ser determinados pela disponibilidade do substrato para a flora bacteriana intestinal . Portanto, mudanças na flora fecal de uma alteração na dieta, ou terapia antimicrobiana, também pode trazer uma mudança nos padrões de fermentação e concentração de ácido orgânico . A quantidade de tais ácidos produzidos em seres humanos é difícil de determinar e apenas um pequeno número de estudos foram realizados que indicam que em adultos, entre 300 mmol e 1-2 mol de ácido são produzidos todos os dias. Verificou-se que o acetato era o principal SCFA produzido em todos os casos e as provas sugerem que as concentrações de SCFA cecal são aproximadamente o dobro das da área recto-sigmóide .dois componentes lácteos demonstraram inibir anteriormente infecções gastrointestinais e / ou estimular bifidobactérias in vitro. O glicomacropeptídeo (GMP), um derivado da caseína-κ, foi extensivamente estudado in vitro e demonstrou inibir a adesão de bactérias, vírus e toxinas à membrana celular através da ligação aos locais receptores do patogéneo . Estes ensaios in vitro também mostraram que as GMP promoveram fortemente o crescimento de Bifidobacterium breve, B. bifidum, B. infantis e Lactococcus lactis. a α-lactalbumina (α-la), que tem uma estrutura terciária comparável às lisozimas do tipo c, demonstrou ter efeitos semelhantes . Pihlanto-Leppälä et al. demonstrou anteriormente que a α-la reduziu a actividade metabólica da Escherichia coli jm103 para apenas 21% do normal. Além disso, o teste de leite de vaca purificado mostrou que α-la era um potente promotor de crescimento para B. infantis e B. breve.

neste estudo, utilizámos a cultura de lotes e um sistema de cultura contínua composta em duas fases para testar as propriedades de fermentação e as actividades bacterianas após a suplementação de alimentos para lactentes com α-la e GMP. O sistema de cultura contínua foi adaptado a partir do modelo de três estágios desenvolvido por Macfarlane et al. . Seu menor volume de operação e taxas de rotatividade mais rápidas tentaram explicar os fatores físicos encontrados em bebês humanos. Testamos se a suplementação de α-la e GMP pode alterar a flora gastrointestinal para dar benefícios semelhantes aos observados em crianças amamentadas.

2 Materiais e métodos

2.1 Lote cultura

Para o anaeróbio lote sistemas de cultura, o basal meio de cultura contido (por litro): 1 g de peptona, 1 g de extrato de levedura, 0,05 g de NaCl, com 0,02 g de K2HPO4, com 0,02 g de KH2PO4, 0,005 g MgSO4·7H2O, 0,005 g de CaCl2·6H2O, 1 g de NaHCO3, 1 ml de Tween 80, 0.0025 g de hemina, 5 µl de vitamina K1, 0, 25 g de cisteína HCl e 0, 25 g de sais biliares dissolvidos em 500 ml de água desionizada, ajustados ao pH 7.0 e esterilizados por autoclavagem. Todos os produtos químicos foram obtidos da Sigma (Poole, Dorset, Reino Unido), salvo indicação em contrário. O meio esterilizado (50 ml) foi colocado em frascos de cultura do lote de 100 ml contendo 0, 5 g (1% p/v) de uma fórmula de ensaio (ingredientes da Arla Foods, Viby, Dinamarca) complementados com α-la (68% p/v) ou GMP (80% p/v) e mantidos numa atmosfera de gás nitrogénio isento de oxigénio. As fórmulas foram comparadas com um padrão contendo 1% (P/P) de lactose. No dia seguinte, uma amostra fecal fresca foi recolhida num saco de stomacher e processada imediatamente. A experiência foi repetida cinco vezes usando cinco doadores diferentes.

os recipientes de cultura do lote foram inoculados com 5 ml de um chorume fecal de 10% (M/v) de voluntários adultos saudáveis preparados com solução salina tamponada com fosfato anaeróbico (PBS, 0, 1 M, pH 7.2) e foram colhidas amostras de 1 ml às vezes 0 (antes de colocar a amostra em cultura do lote), 6 h e 24 h e armazenadas a 4°C até utilização posterior. Para a contagem de bactérias por hibridização fluorescente in situ (FISH), 375-µl triplicates de coleta de amostra foi removido e adicionado a um de 1,5 ml tubo Eppendorf contendo 1125 µl de filtro esterilizado 4% (m/v) de paraformaldeído em PBS (pH 7,2) e fixa por pelo menos 4 h a 4°C. O fixo amostra foi então centrifugado por 5 min a 13 000 x g e o sobrenadante descartado. O sedimento foi ressuspendido em 1 ml de PBS filtrado (pH 7.4) contendo 0,00001% (M/v) de brometo de Cetil trimetilamónio e transferido para um tubo Eppendorf para repelleting (13 000×g, 5 min). Após uma segunda lavagem do sedimento, removeu-se o sobrenadante e ressuspendeu-se cuidadosamente o sedimento em 150 µl de PBS filtrados e 150 µl de etanol a 96% (v/v). A amostra foi bem misturada e armazenada a -20°C durante, pelo menos, 1 h antes da hibridação com uma sonda fluorescente (como descrito abaixo).

2.2 sistema de cultura contínua em dois estágios

o sistema de cultura contínua consistia em dois recipientes de vidro, V1 e V2, ambos com um volume operacional de 100 ml. A temperatura (37°C) e o pH eram automaticamente controlados. O pH da cultura nos vasos era de 5.2 in V1, representing the low pH environment of the proximal colon and 6.5 in V2, indicative of a more neutral pH in the distal colon. Cada fermentador foi magneticamente agitado e o meio de crescimento continuamente carregado com nitrogênio livre de oxigênio (15 ml min-1) e alimentado a partir de um reservatório de meio de vidro por uma bomba peristáltica (Watson−Marlow, Falmouth, Reino Unido) para V1. V1 forneceu sequencialmente V2 através de um overflow e uma série de Weir. O transbordamento do V2 foi levado a um Contentor de resíduos. O meio de cultura consistia em (A) basal médio descrito acima, com 1% (m/v) de lactose adicionado (Sigma, Poole, Dorset, reino UNIDO), (B) leite materno (fornecido pelo Hospital Real de Berkshire, Reading, reino UNIDO) com 0,5 g l−1 l-cisteína-HCl adicionado, (C) testar a fórmula, com 68% (w/v) suplementar α-la, de 1% (w/v) de lactose e de 0,5 g l−1 l-cisteína-HCl, e (D) teste de fórmula com 68% (w/v), GMP, 1% (w/v) de lactose e de 0,5 g l−1 l-cisteína-HCl. Todas as fórmulas foram obtidas a partir de ingredientes da Arla Foods (Viby, Dinamarca) e pré−digeridas utilizando pepsina (575 U por g de proteína) a pH 2 durante 2 h (37°C), seguida de pancreatina (50 U por g de proteína) e 0,5 g de ácido biliar volume L-1 a pH 6,5 para dois h (37°C). Para assegurar a anaerobicidade, foram fervidos e adicionados ao meio 4 ml l−1 de uma solução−mãe de 250 mg de resazurina. Os meios foram então aquecidos a 80 ° C durante 20 minutos, arrefecidos à temperatura ambiente durante a noite e aquecidos a 80°C durante mais 20 minutos antes de serem continuamente recarregados com N2 sem oxigénio. O sistema funcionava a um tempo de retenção (R) de 12 h, calculado como o recíproco da taxa de diluição. O tempo de retenção do sistema constituiu a soma dos valores R individuais em cada fermentador. Cada fermentador foi inoculado com 15 ml de uma chorume fecal fresca de 10% (M/v) proveniente de dadores saudáveis de lactentes entre 1 e 6 meses de idade e alimentado com leite materno com uma fórmula suplementar. O chorume foi preparado usando anaeróbios 0, 1 M PBS (pH 7.2). Todas as experiências foram repetidas cinco vezes utilizando dadores diferentes, com excepção do grupo B (leite materno), onde a experiência foi realizada uma vez utilizando o material fecal de um dador de 3 meses, exclusivamente amamentado. Os grupos C E D continham cada um cinco indivíduos diferentes. As amostras foram colhidas após 1, 3 e 6 meses de idade, a fim de avaliar quaisquer diferenças na microflora fecal e quaisquer alterações na efetividade dos suplementos à medida que os lactentes amadureceram. O sistema de fermentação foi autorizado a estabilizar durante a noite antes do início da bomba média e foi executado durante pelo menos 144 h para estabelecer condições de estado estacionário. Foram colhidas e preparadas amostras de 3 ml do inóculo original (N), Após o equilíbrio (T0), e em condições de estado estacionário (TS), para análise dos peixes, tal como acima descrito.

2.3 contagem bacteriana através de sondas de oligonucleótidos (Quadro 1) para Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp./ Enterococcus, Bacteroides spp. , Clostridium histolyticum group and E. coli foi sintetizada e monolabelada na extremidade 5′ com Cy3 (Ex 552 nm, em 568 nm) por Eurogentec (Abingdon, Reino Unido) ou MWG-Biotech (Milton Keynes, Reino Unido). A hibridação foi efectuada durante a noite a 50 ° C para Bifidobacterium e Clostridium, a 45°C para Lactobacillus e Bacteroides e a 37°C para E. coli. Para hibridação, adicionaram–se a 16 µl de células fixas e aqueceram−se à temperatura adequada 200 µl de tampão filtrado (pH 7,2 mm Tris-HCl, 1,8 m NaCl) contendo 20 ml l-1 de 10% (M/v) de SDS e 64 µl de água de qualidade HPLC. A solução de hibridação pré−aquecida (90 µl) foi adicionada a 10 µl da sonda apropriada (concentração final de 50 NGL-1) e a solução incubada durante a noite num forno de hibridação. Para a sonda E. coli, adicionaram-se 264 µl de tampão de hibridação contendo 35% (v/v) de formamida a 16 µl de células fixas. As células foram lavadas pela adição de 5 ml de tampão de lavagem (20 mM Tris–HCl, pH 7,2, 0,9 M de NaCl) para 5 a 100 µl de hybridised exemplo, manchado, com 20 µl 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), Ex-344, Em 450; 500 ng ml−1) e incubadas em uma hibridização forno por 30 min. Para as contagens totais, 5-12 µl de amostra foi filtrado a vácuo num filtro de policarbonato de tamanho poro de 0,2 µm (Millipore, Watford, UK) e colocado numa lâmina de microscópio. Para evitar o desaparecimento das sondas, foi adicionada ao filtro uma gota do componente a (sondas moleculares Europe, Leiden, Países Baixos). Os diapositivos foram examinados microscopicamente utilizando uma ligação EPI-fluorescente (Nikon UK, Kingston upon Thames, Reino Unido). A luz UV foi usada para contar bactérias tingidas de DAPI e as células tingidas de Cy3 foram enumeradas a 550 nm. Quinze campos aleatórios com uma boa distribuição de células (10-100) foram contados para cada sonda e amostra.

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

2.4 Volatile acid analysis

Undiluted aliquots (1.0 ml) da amostra foram distribuídos em tubos Eppendorf de 1, 5 ml e centrifugados (13 000×g, 5 min) em bactérias granulosas e outros sólidos. O sobrenadante foi então filtrado utilizando um filtro de policarbonato de 0,2 µm e adicionado a quatro partes de acetonitrilo contendo 4, 3 mmol l−1 de ácido 2-etilbutírico como norma interna. A calibração foi feita utilizando soluções padrão de ácido acético, ácido propiónico, Ácido I-butírico, ácido n-butírico, ácido I-valérico, ácido n-valérico, ácido n-caproico e ácido dl-láctico em acetonitrilo. Os ácidos gordos foram determinados por cromatografia gasosa-líquida num sistema GC da série Agilent 6890 (Agilent, Waldbronn, Alemanha) equipado com uma coluna Optima FFAP (25 m×0.32 mm, Macherey-Nagel, Düren, Alemanha) e um detector de ionização por chama. O gás portador hélio foi entregue a um débito de 1,8 ml min-1. Injector, coluna e detector foram definidos a 220 ° C, 140°C (isotérmico) e 220°C, respectivamente. Depois de 5 minutos, a temperatura da coluna foi aumentada para 240°C a 20°C min−1 incrementos para rodar durante mais 15 minutos. Peaks were integrated using a PC running Atlas Lab managing software (Thermo Lab Systems, Mainz, Germany). As concentrações de ácidos gordos foram calculadas comparando as suas Áreas de pico com as do padrão interno e foram expressas em milímetros por litro.

2.5 análise Estatística

a análise Estatística foi realizada por meio da ANOVA one-way (inóculo, versus estado estacionário, TS) para determinar o nível de significância P<0.05 a menos que disposto em contrário.

3 resultados

3.1 Cultura do lote

antes da inoculação, as amostras continham números quase idênticos de Bifidobacterium spp., Bacteroides spp., e Clostridium spp. Os lactobacilos eram menos numerosos. Em culturas que contenham α-la (fig. 1), contagens totais, bifidobactérias, clostrídia, lactobacilos e Bacteroides permaneceram inalterados. A contagem de E. coli diminuiu significativamente (P<0, 01) com suplementação α-la após incubação de 6 h, mas aumentou novamente para os níveis basais (não demonstrado).

1

ontagens médias de bactérias (log10) em culturas fecais adultas e em culturas por lotes contendo meio basal com 1% (m/m) de lactose) ou 1% (m/m) de fórmula de ensaio. Os resultados são médias (log10 por g peso úmido)±S. D. N=fecais de inóculo; 24 h, lactose=cultura após 24 h de incubação contendo lactose; 24 h, a-la/GMP=cultura após 24 h de incubação contendo α-la ou GMP.

1

ontagens bacterianas médias (log10) em inóculo fecal adulto e culturas por lote contendo meio basal com 1% (m/m) de lactose) ou 1% (m / m) de fórmula de ensaio. Os resultados são médias (log10 por g peso úmido)±S. D. N=fecais de inóculo; 24 h, lactose=cultura após 24 h de incubação contendo lactose; 24 h, a-la/GMP=cultura após 24 h de incubação contendo α-la ou GMP.culturas contendo GMP (Fig. 1) geralmente manteve o número de bifidobactérias, Bacteroides, lactobacilos e clostrídia. A contagem de E. coli diminuiu significativamente (P<0, 05) após 6 h de incubação mas, novamente, aumentou para níveis basais (não demonstrado).

3.2 sistema de cultura contínua composto em duas fases

em recipientes que contenham o mesmo meio-padrão (meio basal contendo 1% (m/m) de lactose, Fig. 2), contagens totais de bactérias, bifidobactérias, lactobacilos e clostridia permaneceram constantes. Em contraste, Bacteroides aumentou significativamente em ambos os vasos de fermentação após o equilíbrio e permaneceu mais alto do que os níveis de inóculo em estado estacionário em ambos os vasos (P<0,05). Observou-se uma diminuição estatisticamente significativa (P<0, 05) para a E. coli no recipiente 2 (pH 6, 5) após equilíbrio. Contudo, esta situação não foi mantida e ambos os navios tinham níveis comparáveis de E. coli no estado estacionário, que eram inferiores ao inóculo.

2

ontagens médias de bactérias (log10) em vasos fecais de inóculo e fermentadores de controlo com meio basal contendo 1% (m/m) de lactose ou leite materno (BM). Os resultados são as médias (log10 por g de peso fresco)±S. D. n=inóculo fecal; V1TS = navio 1 em estado estacionário (pH 5.2); V2TS=navio 2 em estado estacionário (pH 6.5).

2

ontagens bacterianas médias (log10) em vasos fecais de inóculo e fermentadores de controlo com meio basal contendo 1% (P / P) de lactose ou leite materno (BM). Os resultados são as médias (log10 por g de peso fresco)±S. D. n=inóculo fecal; V1TS = navio 1 em estado estacionário (pH 5.2); V2TS=navio 2 em estado estacionário (pH 6.5).

após os recipientes que contêm leite materno (Fig. 2) foram deixados para equilibrar durante 24 h, foi observado um aumento estatisticamente significativo (P<0, 05) para lactobacilos no vaso 2 (pH 6.5), que foi mantida até ser atingido o estado estacionário. As contagens de Bifidobacterium permaneceram estáveis. Em contrapartida, a clostridia diminuiu significativamente (P<0,01) em ambos os navios e desapareceu completamente do navio 1 (pH 5.2) em estado estacionário. Observaram-se diminuições semelhantes (P<0, 05) para a E. coli no recipiente 1 (pH 5, 2) mas não no recipiente 2 (pH 6, 5). Os recipientes contendo α-la e inoculados com amostras fecais obtidas de lactentes de 1 e 3 meses de idade apresentaram contagens totais estáveis, bem como níveis de outras bactérias (não apresentados). Quando os fermentadores foram inoculados com espécimes fecais obtidos a partir de lactentes de 6 meses de idade (Fig. 3), as contagens totais e as contagens de lactobacilos permaneceram inalteradas. As contagens de Bacteroides, clostridia e E. coli diminuíram visivelmente após o equilíbrio e observou-se uma redução estatisticamente significativa (P<0, 05) em ambos os níveis de pH. Os vasos contendo GMP e inoculados com amostras fecais de lactentes de 1 e 3 meses de idade apresentaram contagens totais, Bacteroides e E. coli que flutuaram mas permaneceram estáveis. Tal como observado com α-la, o lactobacili mostrou uma ligeira tendência para o aumento em comparação com as amostras iniciais, mas não foi observada significância estatística (não apresentada). Quando os fermentadores foram inoculados com fezes de crianças de 6 meses de idade (Fig. 3), contagens totais, lactobacilos e bifidobactérias permaneceram inalteradas. As contagens de Bacteroides, clostridium e E. coli diminuíram visivelmente após o equilíbrio e observou-se uma redução estatisticamente significativa (P<0, 05), semelhante à observada com a fórmula suplementada com α-la, em ambos os níveis de pH.

3

contagem média de bactérias nos vasos de inóculo e fermentadores (log10) contendo α-la ou GMP utilizando fezes de dadores com 6 meses de idade. Os resultados são as médias (log10 por g de peso fresco)±S. D. n=inóculo fecal; V1TS = navio 1 em estado estacionário (pH 5.2); V2TS=navio 2 em estado estacionário (pH 6.5).

3

contagens bacterianas médias em vasos de inóculo e fermentadores (log10) contendo α-la ou GMP utilizando fezes de dadores com 6 meses de idade. Os resultados são as médias (log10 por g de peso fresco)±S. D. n=inóculo fecal; V1TS=navio 1 em estado estacionário (pH 5.2); V2TS=navio 2 em estado estacionário (pH 6.5).

3.3 ácidos Orgânicos

Total de quantidades de ácidos orgânicos varia de maneira significativa estatisticamente (P<0,05) entre os inocula e o exemplo de times com média total de ácido para o inocula sendo 4.28 mmol l−1, 8.16 mmol l−1 e 15.64 mmol l−1 em relação ao 73.80 mmol/l−1 (intervalo de 18,93–160.49), 39.29 mmol l−1 (intervalo 15h30–100.28) e 80.49 mmol l−1 (intervalo a 28.07–177.34) 1, 3 e 6 meses de idade, doadores, respectivamente. Os erros-padrão foram 4.96%, 3.10%, 2.61%, 1.80%, 0.91%, 0.84%, 1.91% e 5.12% para acetato, propionato, I-butirato, n-butirato, I-valerato, n-valerato, caproato e lactato, respectivamente. O acetato era o ácido predominante em todos os grupos (Fig. 4) seguido de lactato e propionato, com uma média de 63%, 21%, 11% do ácido total, respectivamente. o d (-) – lactato foi encontrado predominantemente em comparação com o L (+) – lactato que ocorreu apenas esporadicamente e em quantidades mínimas. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos de estudo para isoácidos, valerato e caproato, que ocorreram em quantidades vestigiais.

4

quantidades relativas médias (%) de ácido nos recipientes fermentadores. Dietas: N=inóculo; a-la (α-la)=α-lactalbumina; GMP=glicomacropéptido; BM=leite materno. Idade do dador: 1=1 mês; 3=3 meses; 6=6 meses após o nascimento.

4

quantidades relativas médias (%) de ácido nos recipientes fermentadores. Dietas: N=inóculo; a-la (α-la)=α-lactalbumina; GMP=glicomacropéptido; BM=leite materno. Idade do dador: 1=1 mês; 3=3 meses; 6=6 meses após o nascimento.

houve, no entanto, uma diferença estatisticamente significativa (p<0.05) entre os grupos para as quantidades relativas dos ácidos principais e n-butirato. O acetato e o lactato ocorreram geralmente numa razão de 3: 2, com excepção do inóculo de lactentes de 6 meses, onde predominou o lactato (P<0,01). as concentrações de N-butirato aumentaram geralmente com a idade do dador, enquanto que o propionato diminuiu até ambas serem aproximadamente iguais em termos de concentração. Foram também encontradas pequenas quantidades de I-butirato em todos os grupos etários dadores, bem como no grupo do leite materno.

4 discussão

com base em estudos anteriores, acredita-se geralmente que os lactentes podem beneficiar de microbiota que são numericamente dominados por bifidobactérias e / ou lactobacilos . verificou-se previamente que a α-La e a GMP estimulam significativamente in vitro culturas puras seleccionadas de bifidobactérias. No entanto, resultados semelhantes não foram vistos aqui na cultura mista. Em culturas de lotes preliminares inoculadas com material fecal adulto, não foi observado efeito estatisticamente significativo na microflora benéfica. O mesmo aconteceu com ambos os suplementos quando utilizados em cultura contínua inoculados com material fecal de crianças de vários grupos etários. Apesar disso, as bifidobactérias foram o grupo dominante nas fórmulas de teste e no controle do leite materno, onde as bifidobactérias também permaneceram constantes durante todo o experimento. Um efeito mais profundo foi visto para lactobacilli. O leite materno aumentou significativamente o lactobacilos. Um aumento menor, mas estatisticamente insignificante, das contagens de lactobacilos foi demonstrado com BPF nas fezes de crianças de 3 meses de idade, uma tendência que continuou em experiências com material fecal de crianças de 6 meses de idade.acredita-se que ambos os suplementos de fórmula também possuem algum efeito inibitório sobre uma variedade de patógenos. Demonstrou-se anteriormente que a GMP possui vários atributos anti-patogénicos tanto na sua cadeia de hidratos de carbono contendo ácido N-acetilneuraminico (ácido siálico) como na sua porção polipéptida . A presença de ácidos siálicos na superfície das células intestinais é muitas vezes necessária para a infecção de uma variedade de patógenos entéricos e uma fonte exógena de GMP pode inibir a adesão bacteriana, que é essencial para a infecção. Isto foi demonstrado por Kawakami inibindo a adesão de E. coli enteropatogénica às linhas celulares intestinais humanas. Geralmente, a concentração de componentes contendo ácido siálico é mais elevada no leite humano do que nas fórmulas para lactentes. Um efeito inibitório da GMP sobre Bacteroides, clostridia e E. neste estudo, foi observada coli, três organismos potencialmente patogénicos. Enquanto em culturas de lotes preliminares usando contagens de materiais fecais adultos foram geralmente conservadas, uma tendência descendente foi visto na cultura contínua. No entanto, uma redução estatisticamente significativa destes organismos foi detectada apenas em culturas com material fecal de lactentes de 6 meses de idade. Foram observados resultados semelhantes no leite materno, que diminuíram significativamente a clostridia e a E. coli, enquanto o Bacteroides permaneceu inalterado. Em contraste, o meio basal aumentou significativamente os níveis de Bacteroides, mostrando que as alterações na composição da flora não eram resultado de lavagem, mas dependia do meio de fermentação.

α-La, um Componente Regulador da lactose sintase, partilha um elevado nível de identidade sequencial para lisozimas do tipo c e tem uma estrutura tridimensional semelhante sugerindo que eles vieram de um gene ancestral comum . Foram realizados vários estudos que sugerem que a α-la pode ter efeitos semelhantes sobre os agentes patogénicos . Em contraste, Pelligrini et al. descobriu-se que a digestão proteolítica por tripsina e pepsina produzia três peptídeos com propriedades bactericidas, principalmente ativos contra organismos Gram-negativos. As propriedades bacteriostáticas do α-la hidrolisado foram observadas especificamente para a E. coli. Neste estudo foi observado um efeito inibitório da α-la sobre Bacteroides, clostridia e E. coli. Mais uma vez, foi detectada uma redução estatisticamente significativa destes organismos apenas em culturas que apresentavam material fecal de lactentes de 6 meses de idade, resultado comparável ao obtido para os controlos do leite materno.

o nosso estudo confirmou que o acetato foi o principal CQA amamentado, em comparação com os lactentes alimentados com frasco, juntamente com baixas concentrações de propionato e uma ausência quase total de butirato nos primeiros 117 dias de vida . Lactato e acetato geralmente ocorreram em uma razão de 2: 3, o que confirma o papel predominante de bifidobactérias na microflora, como descrito por Rasic e Kurmann . Uma alta incidência de lactato também é típica de fermentação incompleta ou rápida comumente associada a um pH ácido, como visto em bebês amamentados . No entanto, isto não foi confirmado aqui, uma vez que o inóculo fecal de dadores alimentados com leite materno, fermentado, produziu um perfil ácido quase completamente desprovido de lactato. Por outro lado, as amostras fecais que fermentavam a fórmula suplementada com α-la e GMP produziram um perfil ácido característico da fermentação por fórmula com concentrações mais elevadas de N – butirato, que aumentou com a idade do dador . No entanto, o acetato continuou a ser predominante, tal como observado em lactentes exclusivamente amamentados.

em resumo, mostramos os efeitos microbiológicos da suplementação de fórmulas para lactentes com α-la e GMP. Em comparação com estudos in vitro anteriores que utilizaram culturas puras de bifidobactérias, não foi observado um efeito bifidogénico dos dois suplementos utilizando inocula fecal. Contudo, foi observada uma redução estatisticamente significativa da microflora potencialmente patogénica, semelhante à observada em lactentes. Assim, neste contexto, pode concluir-se que a suplementação α-la e GMP em combinação com elevadas quantidades de acetato tem efeitos benéficos na microflora humana.os investigadores gostariam de agradecer à Sra. Alethea Hill, bem como aos doadores e aos seus pais pelo seu apoio, entusiasmo e ajuda inestimável para o estudo.

Borriello
S. P.

(

1986

)

flora Microbiana do trato gastrointestinal

. In:

Microbial Metabolism in the Digestive Tract

(

Hill
M. J.

, Ed.), p.

2 div– –

16

.

CRC Press

,

Boca Raton, FL

.

div>

(

1990

)

o desenvolvimento da flora intestinal anaeróbia em recém-nascidos

. progresso. Med.

108
420

424

.

Mitsuoka
T.

(

1995

)

Comparativa ecologia microbiana intestinal e o metabolismo no homem e animais

. Em:

Médica e Odontológica Aspectos de microrganismos Anaeróbios

(

Duerden
B. I.

Wade
W. G.

Braseiro
J. S.

Eley
A.

Wren
B.

Hudson
M. J

, Eds.), p.

87 div– –

107

.

Science Reviews

.

Harmsen
H. J. M.

Wildeboer-Veloo
A. C. M.

Raangs
G. C.

et al. (

2000

)

análise do desenvolvimento da flora intestinal em crianças amamentadas e alimentadas com fórmulas utilizando métodos de identificação molecular e detecção

.

J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr.
30
61

67

.

Salminen
S.

Bouley
C.

Boutron-Ruault
M.-C.

et al. (

1998

)

Functional food science and gastrintestinal physiology and function

.

Br. J. Nutr.
80
S147

S171

.

Harmsen
H. J. M.

Gibson
G. R.

et al. (

1999

)

comparação de contagens celulares praticáveis e hibridização por fluorescência in situ utilizando sondas específicas baseadas em ARNr para a quantificação de bactérias fecais humanas

. Microbiol HEMS. Lett.

183
125

129

.

Macfarlane
, G. T.

Gibson
G. R.

Macfarlane
S.

(

1994

)

Curta cadeia de ácidos graxos e a produção de lactato pelo intestinal de humanos bactérias cultivadas em lote e contínua da cultura

. Em:

Ácidos Graxos de Cadeia Curta

(

Binder
H. J.

Cummings
J. H.

Soergel
K. H.

, Eds.), p.

44

60

.

Kluwer Publishing

,

London

.

Allison
C.

McFarlan
C.

Macfarlane
, G. T.

(

1989

)

Estudos misto populações de humanos bactérias intestinais crescido em um único e multicelulares contínua sistemas de cultura

.

Appl. Cerca. Microbiol.
55
679

683

.

Pântano
P.

(

1995

)

o papel da cultura contínua na modelização da microflora humana

.

J. Chem. Tecnologia. Biotechnol.
64
1

9

.

Veilleux
B. G.

Rowland
I.

(

1981

)

a Simulação do ecossistema intestinal de ratos usando uma de duas fases contínua do sistema de cultura

.

J. Gen. Microbiol.
123
103

115

.

Macfarlane
, G. T.

Macfarlane
S.

Gibson
G. R.

(

1998

)

a Validação de um três-fase composto contínua do sistema de cultura para a investigação do efeito do tempo de retenção sobre a ecologia e o metabolismo de bactérias no cólon humano

. Microb. Ecol.

35
180

187

.

Edwards
C. A.

Parrett
A. M.

Balmer
S.E.

Wharton
A.

(

1994

)

Fecais ácidos graxos de cadeia curta no amamentados e os bebés alimentados com fórmulas

. Acta Pediatr .

83
459

462

.

Cummings
J. H.

(

1983

)

Fermentação em humanos intestino grosso: Evidências e implicações para a saúde

.

Lancet
1
1206

1208

.

Midtvedt
T.

Carlstedt-Duque
B.

Høverstad
T.

et al. (

1986

)

Influence of peroral antimicrobial on the biotransformatory activity of the intestinal microflora in healthy subject

.

Eur. J. Blink. Investir.
16
11

17

.

Kawakami
H.

(

1997

)

Biological significance of sialic acid-containing substances in milk and their application

.

Recent Res. Dev. Agric. Biol. Chem.
1

,

193

207

.

Idota
T.

Kawakami
H.

Nakajima
I.

(

1994

)

Growth-promoting effects of N-actelylneuraminic acid containing substances on bifidobacteria

.

Biosci. Biotechnol. Biochem.
58
1720

1722

.

Bouhallab
S.

Favrot
C.

Maubois
J. L.

(

1993

)

promoção do Crescimento da atividade do tríptico resumo do caseinomacropeptide por Lactococcus lactis ssp. lactis

.

Leite
73
73

77

.

Xue
Y

Lui
J. N.

Sol
Z

Fosco
Z

Wu
C.

Zhu
D.

(

2001

)

α-Lactalbumina mutante atuando como lisozima

. estrutura proteica . Funct. Genet.

42
17

22

.

Pihlanto-Lappälä
A.

Marnila
P.

Hubert
L.

Rokka
T.

Korhonen
H. J. T.

do Carpo
M.

(

1999

)

O efeito de α-lactalbumina e β-lactoalbumina hydrosylates sobre a atividade metabólica de Escherichia coli JM103

.

J. Appl. Microbiol.
87
540

545

.

promotores do leite humano e de vaca

Pediatr. Res.
29
208

213

.

/div> et al. (

1998

)

variações das populações bacterianas em fezes humanas medidas por hibridação fluorescente in situ com sondas de oligonucleótido orientadas para o grupo 16S rRNA

.

Appl. Cerca. Microbiol.
64
3336

3345

.

Neeser
J. R.

Golliard
M.

Woltz
A.

Rouvet
M.

Dillmann
M. L.

Guggenheim
B.

(

1994

)

In vitro modulador oral da adesão bacteriana a saliva revestido hydroxypatite esferas de caseína do leite, derivados

. Microbiol Oral. Imunol.

9
193

201

.

Mundo
, A. E.

Adlerberth
I.

(

2000

)

a amamentação e a microflora intestinal do bebê – implicações para a proteção contra doenças infecciosas

. Em:

efeitos a curto e a longo prazo da amamentação sobre a saúde das crianças

(

Keletzo
B.

et al. , Disfuncao.).

Kluwer Academic / Plenum Publishers

,

New York

.

Pelligrini
A.

Thomas
U

Bramaz
N.

Hunziker
P.

von Fellenberg
R.

(

1999

)

Isolamento e identificação de três bactericida de domínios na encefalopatia alfa-lactalbumina molécula

. Biochim. Biophys. Acta

1426
439

448

.

Siigur
U

Ormission
A.

Tamm
A.ácidos gordos de cadeia curta fecais em lactentes e lactentes alimentados a biberão. Acta Pediatr .
82
536

538

.

Wolin
M. J.

Yerry
S.

Miller
T. L.

Zhang
Y

Banco
S.

(

1998

)

alterações na produção de etanol, ácidos e h2 a partir da glucose pela flora fecal do lactente de 16 a 158 dias amamentado

.

J. Nutr.
128
85

90

.

div>.

Birkhauser Verlag

,

Basel

.

Tianan
J.

Savaiano
D. A.

(

1997

)

Edição de fermentação colônica por bifidobactérias e pH in vitro

. Dig. Dez. Ciência.

42
2370

2377

.

Deixe uma resposta

O seu endereço de email não será publicado.