zastosowanie hodowli wsadowej i dwustopniowego systemu ciągłej hodowli do badania wpływu suplementacji α-laktoalbuminy i glikomakropeptydu na mieszane populacje ludzkich bakterii jelitowych

Streszczenie

niektóre czynniki mleczne mogą sprzyjać wzrostowi mikroflory żołądkowo-jelitowej przyjaznej gospodarzowi. Może to wyjaśniać, dlaczego niemowlęta karmione piersią doświadczają mniej infekcji jelitowych niż ich odpowiedniki karmione formułą. W tym badaniu badano wpływ suplementacji formułą dwoma takimi czynnikami. Do fermentacji preparatów uzupełnionych glikomakropeptydem i α-laktoalbuminą w dwuetapowym modelu ciągłej hodowli użyto odchodów niemowlęcych. Bakteriologię oznaczano poprzez hybrydyzację fluorescencyjną in situ. Naczynia zawierające mleko matki, a także α-laktoalbuminę i glikomakropeptyd miały stabilną liczbę bifidobakterii, podczas gdy pałeczki kwasu mlekowego znacznie wzrosły tylko w naczyniach z mlekiem matki. Bacteroides, clostridia i Escherichia coli zmniejszyły się znacząco we wszystkich przebiegach. Octan był głównym kwasem znalezionym wraz z dużymi ilościami propionianu i mleczanu. Suplementacja preparatów dla niemowląt odpowiednimi białkami mleka może być przydatna w symulowaniu korzystnego działania bakteriologicznego mleka matki.

1 Wprowadzenie

ludzkie jelito grube jest złożonym ekosystemem zawierającym szeroką gamę bakterii. Uważa się, że co najmniej 400 różnych gatunków bakterii występuje w tym samym czasie, przy czym na g kału znajduje się do 1012 bakterii . Mikroflora jest nabywana przy porodzie, a sterylny noworodek zostaje skolonizowany przez różne bakterie podczas procesu porodu . W ciągu pierwszych kilku dni życia przeważają niewymagające pod względem odżywczym prokarioty, takie jak enterobakterie, gronkowce i paciorkowce (w tym enterokoki). W pierwszym tygodniu życia powstają rodzaje takie jak bifidobakterie i Bacteroides . Uważa się, że niemowlęta karmione piersią mają florę okrężnicy, która jest numerycznie zdominowana przez bifidobakterie, podczas gdy te, które są karmione formułą, mają bardziej złożoną mikrobiotę, która jest podobna w składzie do tych dorosłych . Bifidobakterie mogą wywierać silne działanie antybakteryjne przeciwko różnym patogenom jelitowym, takim jak niektóre Enterobacteriaceae i Clostridium spp. Jako takie, przewaga bifidobakterii jest postrzegana jako jeden wskaźnik poprawy zdrowia jelit . Obserwacje normalnej mikroflory jelitowej zostały w dużej mierze zaczerpnięte z ilościowej Kultury płytki i charakterystyki fenotypowej, które mają ograniczenia w zakresie wydajności odzysku i podmiotowości operatora .

Ponadto, ponieważ bliższa okrężnica jest fizycznie niedostępna do rutynowych celów, większość badań mikrobiologicznych nad fermentacją przeprowadzono z bakteriami kału w hodowli wsadowej lub chemostatach jednostopniowych . Hodowla wsadowa pozwala na określenie fermentowalności różnych substratów w krótkich okresach (24 h). Istnieją jednak znaczne różnice w dostępności substratu i warunkach środowiskowych między okrężnicą proksymalną i dystalną, których nie można symulować w systemie pojedynczego naczynia.

w przeciwieństwie do tego, systemy in vitro wykorzystujące wiele naczyń fermentacyjnych ustawionych szeregowo mają zalety, ponieważ są w stanie modelować bardziej złożone warunki środowiskowe, jednocześnie umożliwiając przestrzenną i czasową heterogeniczność . Na przykład wykazano, że zadowalające wyniki daje dwustopniowy chemostat z recyklingiem komórek od drugiego do pierwszego etapu . Dalsze udoskonalenie do modelowania dorosłego człowieka jelita grubego zostało przeprowadzone przez Macfarlane et al. stosując trójstopniowy złożony system hodowli ciągłej. Zostało to potwierdzone mikrobiologicznie w stosunku do ludzkiego materiału jelita grubego uzyskanego od ofiar nagłej śmierci podczas autopsji. Takie modele są cenne dla badania mikroflory jelitowej, ponieważ można kontrolować różne warunki fizykochemiczne. Ma to wyraźne zalety ekonomiczne, ale jest szczególnie istotne w planowaniu badań na ludziach.

różnice we florze kału odzwierciedlają się również w różnych wzorcach mleczanowych, krótko- (SCFA) i rozgałęzionych kwasów tłuszczowych, które są pośrednimi i końcowymi produktami fermentacji bakteryjnej . Ich szybkość produkcji i przebieg fermentacji można również określić na podstawie dostępności substratu dla jelitowej flory bakteryjnej . W związku z tym zmiany we florze kału wynikające ze zmian w diecie lub terapii przeciwdrobnoustrojowej mogą również spowodować zmianę wzorców fermentacji i stężenia kwasów organicznych . Ilość takich kwasów wytwarzanych u ludzi jest trudna do określenia i przeprowadzono tylko niewielką liczbę badań, które wskazują, że u dorosłych każdego dnia Wytwarza się od 300 mmol do 1-2 moli kwasu. Stwierdzono, że octan jest głównym SCFA wytwarzanym we wszystkich przypadkach, a dowody sugerują, że stężenia Scfa w kale są w przybliżeniu dwukrotnie większe niż w obszarze rekto-esicy .

w badaniach in vitro wykazano, że dwa składniki mleka hamują infekcje przewodu pokarmowego i (lub) stymulują bifidobakterie. Glikomakropeptyd (GMP), pochodna κ-kazeiny, był szeroko badany in vitro i wykazano, że hamuje adhezję bakterii, wirusów i toksyn do błony komórkowej poprzez wiązanie się z miejscami receptorowymi patogenu . Te testy in vitro wykazały również, że GMP silnie promuje wzrost Bifidobacterium breve, B. bifidum, B. infantis i Lactococcus lactis. wykazano, że α-laktoalbumina (α-la), która ma strukturę trzeciorzędową porównywalną do lizozymów typu c, ma podobne działanie . Pihlanto-Leppälä et al. wcześniej wykazano, że α-la obniżył aktywność metaboliczną Escherichia coli jm103 do zaledwie 21% normy. Dodatkowo, badanie oczyszczonego mleka krowiego wykazało, że α-la jest silnym promotorem wzrostu dla B. infantis I B. breve.

w tym badaniu wykorzystaliśmy hodowlę wsadową i dwustopniowy system ciągłej hodowli związku do badania właściwości fermentacji i aktywności bakterii po suplementacji pasz dla niemowląt α-la i GMP. System hodowli ciągłej został zaadaptowany z trójstopniowego modelu opracowanego przez Macfarlane et al. . Jego mniejsza objętość operacyjna i szybsze obroty starały się uwzględnić czynniki fizyczne występujące u niemowląt. Przetestowaliśmy, czy suplementacja α-la i GMP może zmienić florę przewodu pokarmowego, aby dać podobne korzyści do obserwowanych u niemowląt karmionych piersią.

2 Materiały i metody

2.1 Hodowla wsadowa

dla beztlenowych systemów hodowli wsadowej podstawowe podłoże hodowlane zawarte (na litr): 1 g peptonu, 1 g ekstraktu drożdżowego, 0,05 g NaCl, 0,02 g K2HPO4, 0,02 g KH2PO4, 0,005 g MgSO4·7H2O, 0,005 g CaCl2·6H2O, 1 g g NaHCO3, 1 ml Tween 80, 0.0025 g heminy, 5 µl witaminy K1, 0,25 g HCl cysteiny i 0,25 g soli żółciowych rozpuszczonych w 500 ml dejonizowanej wody, o pH 7,0 i wysterylizowanych w autoklawie. Wszystkie chemikalia zostały uzyskane z Sigma (Poole, Dorset, Wielka Brytania), chyba że zaznaczono inaczej. Jałowe podłoże (50 ml) umieszczano w butelkach do hodowli wsadowych o pojemności 100 ml zawierających 0,5 g (1% w/v) wzoru testowego (Arla Foods Ingredients, Viby, Dania) uzupełnionego α-la (68% w/v) lub GMP (80% W/v) i utrzymywano w atmosferze beztlenowego gazu azotowego. Wzory porównano ze standardem zawierającym 1% (w/w) laktozy. Następnego dnia świeżą próbkę kału pobrano do worka stomacher i natychmiast przetworzono. Eksperyment powtórzono pięć razy przy użyciu pięciu różnych dawców.

naczynia do hodowli wsadowej zaszczepiono 5 ml zawiesiny 10% (w/v) kału od zdrowych dorosłych ochotników przygotowanej beztlenową roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, 0,1 M, pH 7,2) i pobrano 1 ml próbek w czasie 0 (przed umieszczeniem próbki w hodowli wsadowej), 6 h i 24 h i przechowywano w temperaturze 4°C do dalszego użycia. Do liczenia bakterii metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) usunięto 375-µl triplikatów pobranej próbki i dodano do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml zawierającej 1125 µl sterylizowanego filtrem 4% (w/v) paraformaldehydu w PBS (pH 7,2) i utrwalono przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 4°C. stałą próbkę odwirowano następnie przez 5 minut w temperaturze 13 000×g, a supernatant odrzucono. Osad zawieszono w 1 ml przefiltrowanego PBS (pH 7,4) zawierającego 0,00001% (w/v) bromku cetylo-trimetylo-amonowego i przeniesiono do probówki Eppendorfa w celu odpylenia (13 000×g, 5 min). Po drugim przemyciu osadu, supernatant usunięto i osad ponownie zawieszono dokładnie w 150 µl przefiltrowanego PBS i 150 µl 96% (v/v) etanolu. Próbkę dobrze wymieszano i przechowywano w temperaturze -20°C przez co najmniej 1 godzinę przed hybrydyzacją za pomocą sondy fluorescencyjnej (jak opisano poniżej).

2.2 dwustopniowy system hodowli ciągłej

system hodowli ciągłej składał się z dwóch szklanych naczyń, V1 i V2, o objętości roboczej 100 ml. Temperatura (37°C) i pH były automatycznie kontrolowane. Kultura pH w naczyniach wynosiła 5.2 W V1, reprezentujący środowisko o niskim pH bliższej okrężnicy i 6,5 W v2, wskazujące na bardziej neutralne pH w dalszej okrężnicy. Każdy fermentor miesza się magnetycznie, a medium wzrostu stale spryskuje azotem beztlenowym (15 ml min-1) i doprowadza ze zbiornika medium szklanego za pomocą pompy perystaltycznej (Watson-Marlow, Falmouth, Wielka Brytania) do V1. V1 kolejno zasilane V2 przez przelewy i szereg jazów. Przepełnienie z V2 doprowadzono do pojemnika na odpady. Podłoże hodowlane składało się z (a) podłoża podstawowego opisanego powyżej z dodatkiem 1% (w/v) laktozy (Sigma, Poole, Dorset, Wielka Brytania), (B) mleka kobiecego (dostarczonego przez Royal Berkshire Hospital, Reading, Wielka Brytania) z dodatkiem 0,5 g l−1l-cysteiny-HCl, (C) wzoru testowego z dodatkiem 68% (w/v) α-la, 1% (w/v) laktozy i 0,5 g l−1l-cysteiny-HCl oraz (D) wzoru testowego z 68% (w/v) laktozy/V) GMP, 1% (W / V) laktozy i 0,5 g l−1l-cysteiny-Hcl. Wszystkie formuły otrzymano ze składników Arla Foods (Viby, Dania) i predigestowano przy użyciu pepsyny (575 U na g białka) przy pH 2 przez 2 godziny (37°C), a następnie pankreatyny (50 U na g białka) i 0,5 g L−1 objętościowego kwasu żółciowego przy pH 6,5 przez 2 godziny (37°C). Aby zapewnić beztlenowość, gotowano 4 ml l−1 podstawowego roztworu resazuryny o stężeniu 250 mg L−1 i dodano do podłoża. Następnie media ogrzewano do temperatury 80 ° C przez 20 minut, schładzano do temperatury pokojowej przez noc i ogrzewano do temperatury 80°C przez kolejne 20 minut, a następnie poddawano ciągłemu spryskiwaniu wolnym od O2 N2. Układ działał w czasie retencji (R) wynoszącym 12 h, obliczonym jako odwrotność szybkości rozcieńczania. Czas retencji układu stanowił sumę indywidualnych wartości R w każdym fermentorze. Każdy fermentor zaszczepiono 15 ml świeżej zawiesiny 10% (w/v) kału od zdrowych dawców niemowląt w wieku od 1 do 6 miesięcy i karmiono mlekiem matki formułą uzupełniającą. Zawiesinę przygotowano przy użyciu beztlenowego 0,1 M PBS (pH 7,2). Wszystkie eksperymenty powtórzono pięć razy z użyciem różnych dawców, z wyjątkiem grupy B (mleko matki), gdzie eksperyment przeprowadzono raz z użyciem kału 3-miesięcznego, wyłącznie karmionego piersią dawcy. Każda z grup C i D składała się z pięciu różnych osobników. Próbki pobrano po 1, 3 i 6 miesiącu życia w celu oceny wszelkich różnic w mikroflorze kału i wszelkich zmian w skuteczności suplementów w miarę dojrzewania niemowląt. System fermentacji pozwalał na zrównoważenie przez noc przed uruchomieniem pompy medium i był uruchamiany przez co najmniej 144 godziny w celu ustalenia warunków stanu ustalonego. Pobrano 3-ml próbek pierwotnego inokulum (N), po zrównoważeniu (T0) i w warunkach stacjonarnych (TS) i przygotowano do analizy ryb, jak opisano powyżej.

2.3 Oznaczanie liczby bakterii przez ryby

sondy Oligonukleotydowe (Tabela 1) dla Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp./ Enterococcus, Bacteroides spp. , Clostridium histolyticum group i E. coli zsyntetyzowano i oznaczono monolaminą na końcu 5′ Cy3 (Ex 552 nm, Em 568 nm) przez Eurogentec (Abingdon, Wielka Brytania) lub MWg-Biotech (Milton Keynes, Wielka Brytania). Hybrydyzację przeprowadzono przez noc w temperaturze 50°c Dla Bifidobacterium i Clostridium, w temperaturze 45°C dla Lactobacillus i Bacteroides oraz w temperaturze 37°C Dla E. coli. Do hybrydyzacji dodano 200 µl przefiltrowanego buforu (40 mM Tris–HCl pH 7,2, 1,8 M NaCl) zawierającego 20 ml l−1 z 10% (w/v) SDS i 64 µl wody klasy HPLC do 16 µl stałych komórek i ogrzano do odpowiedniej temperatury. Wstępnie nasycony roztwór hybrydyzacji (90 µl) dodano do 10 µl odpowiedniej sondy (stężenie końcowe 50 ng µl−1) i roztwór inkubowano przez noc w piecu hybrydyzacji. W przypadku sondy E. coli do 16 µl stałych komórek dodano 264 µl buforu hybrydyzacyjnego zawierającego 35% (v/v) formamidu. Komórki przemyto przez dodanie 5 ml buforu do przemywania (20 mM Tris–HCl pH 7,2, 0,9 M NaCl) do 5-100 µl hybrydyzowanej próbki, zabarwiono 20 µl 4′, 6-diamidino-2−fenylindolu (dapi, Ex 344, Em 450; 500 ng ml-1) i inkubowano w piecu do hybrydyzacji przez 30 minut. Dla całkowitej liczby, 5-12 µl próbki filtrowano próżniowo na filtrze poliwęglanowym o wielkości porów 0,2 µm (Millipore, Watford, Wielka Brytania) i umieszczano na szkiełku mikroskopowym. Aby uniknąć blaknięcia sond, do filtra dodano jedną kroplę SlowFade-Light Antifade Kit component A (Molecular Probes Europe, Leiden, Holandia). Szkiełka zbadano mikroskopowo za pomocą przystawki EPI-fluorescencyjnej (Nikon UK, Kingston upon Thames, UK). Do liczenia bakterii barwionych DAPI użyto światła UV, a komórki barwione Cy3 wyliczono przy 550 nm. Dla każdej sondy i próbki zliczono piętnaście losowych pól o dobrym rozkładzie komórek (10-100).

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

2.4 Volatile acid analysis

Undiluted aliquots (1.0 ml) próbki dozowano do probówek Eppendorfa o pojemności 1,5 ml i odwirowywano (13 000×g, 5 min) na bakterie granulowane i inne ciała stałe. Supernatant następnie przesączono za pomocą filtra poliwęglanowego 0,2 µm i dodano do czterech części acetonitrylu zawierającego 4,3 mmol l−1 kwasu 2-etylomasłowego jako wewnętrzny wzorzec. Kalibrację przeprowadzono stosując wzorcowe roztwory kwasu octowego, kwasu propionowego, kwasu i-masłowego, kwasu N-masłowego, kwasu i-walerianowego, kwasu N-walerianowego, kwasu N-kapronowego i dl-kwasu mlekowego w acetonitrylu. Kwasy tłuszczowe oznaczono metodą chromatografii gazowo-cieczowej na systemie Agilent serii 6890 Gc (Agilent, Waldbronn, Niemcy) wyposażonym w kolumnę Optima Ffap (25 m×0,32 mm, Macherey-Nagel, Düren, Niemcy) i detektor jonizacji płomieniowej. Gaz nośny dostarczano z prędkością przepływu 1,8 ml min−1. Wtryskiwacz, kolumna i detektor ustawiono odpowiednio w temperaturze 220°C, 140°C (izotermiczna) i 220°C. Po 5 minutach temperaturę kolumny zwiększono do 240°C przy 20°C min−1, aby pracować przez kolejne 15 minut. Peaks zostały zintegrowane za pomocą komputera z oprogramowaniem do zarządzania Atlas Lab (Thermo Lab Systems, Moguncja, Niemcy). Stężenia kwasów tłuszczowych obliczono poprzez porównanie ich obszarów szczytowych z obszarami wzorca wewnętrznego i wyrażono je w milimolach na litr.

2.5 analiza statystyczna

analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu jednokierunkowego ANOVA (inokulum, versus steady-state, TS) w celu określenia istotności przy p< 0.05, o ile nie określono inaczej.

3 Wyniki

3.1 hodowla wsadowa

przed zaszczepieniem próbki zawierały prawie identyczną liczbę Bifidobacterium spp., Bacteroides spp., oraz Clostridium spp. Bakterie kwasu mlekowego były mniej liczne. W kulturach zawierających α-la (rys. 1), liczba całkowita, bifidobacteria, clostridia, lactobacilli i Bacteroides pozostały niezmienione. Liczba bakterii E. coli znacznie się zmniejszyła (P<0,01) przy suplementacji α-la po 6 h inkubacji, ale ponownie wzrosła do poziomu wyjściowego (nie wykazano).

1

średnia liczba bakterii (log10) w DOROSŁYM inokulum z kału i hodowlach wsadowych zawierających podłoże podstawowe z 1% (m/m) laktozą) lub 1% (m/m) wzorem testowym. Wyniki to średnia (log10 na G mokrej masy)±S. D. N=inokulum z kału; 24 h, laktoza=hodowla po 24 h inkubacji zawierającej laktozę; 24 h, a-la/GMP=hodowla po 24 h inkubacji zawierającej α-la lub GMP.

1

średnia liczba bakterii (log10) w DOROSŁYM inokulum z kału i hodowlach wsadowych zawierających podłoże podstawowe z 1% (m/m) laktozą) lub 1% (m / m) wzorem testowym. Wyniki to średnia (log10 na G mokrej masy)±S. D. N=inokulum z kału; 24 h, laktoza=hodowla po 24 h inkubacji zawierającej laktozę; 24 h, a-la/GMP=hodowla po 24 h inkubacji zawierającej α-la lub GMP.

Kultury zawierające GMP (rys. 1) ogólnie utrzymywane liczby bifidobakterii, Bacteroides, lactobacilli i clostridia. Liczba bakterii E. coli znacznie się zmniejszyła (P<0,05) po 6 godzinach inkubacji, ale ponownie wzrosła do poziomu podstawowego (nie wykazano).

3.2 dwustopniowy złożony system hodowli ciągłej

w naczyniach zawierających to samo podłoże wzorcowe (podłoże podstawowe zawierające 1% wagowych laktozy, Fig. 2), całkowita liczba bakterii, bifidobacteria, lactobacilli i clostridia pozostały stałe. W przeciwieństwie do tego, Bacteroides znacznie zwiększył się w obu naczyniach fermentacyjnych po osiągnięciu równowagi i pozostawał wyższy niż poziom inokulum w stanie stacjonarnym w obu naczyniach (P< 0,05). Statystycznie istotne zmniejszenie (p <0,05) można było zaobserwować dla E. coli w naczyniu 2 (pH 6,5) po zrównoważeniu. Jednak nie utrzymało się to i oba naczynia wykazywały porównywalne poziomy E. coli w stanie stacjonarnym, które były niższe niż inokulum.

2

średnia liczba bakterii (log10) w inokulum kału i kontrolnych naczyniach fermentacyjnych z podłożem podstawowym zawierającym 1% (w/w) laktozy lub mleka kobiecego (BM). Wyniki są średnią (log10 na g masy mokrej)±S. D. N=inokulum z kału; V1TS=naczynie 1 w stanie ustalonym (pH 5,2); V2TS=naczynie 2 w stanie ustalonym (pH 6,5).

2

średnia liczba bakterii (log10) w inokulum kału i kontrolnych zbiornikach fermentacyjnych z podłożem podstawowym zawierającym 1% (w/w) laktozy lub mleka kobiecego (BM). Wyniki są średnią (log10 na g masy mokrej)±S. D. N=inokulum z kału; V1TS=naczynie 1 w stanie ustalonym (pH 5,2); V2TS=naczynie 2 w stanie ustalonym (pH 6,5).

Po naczyniach zawierających mleko matki (rys. 2) pozostawiono do równowagi przez 24 godziny, zaobserwowano statystycznie znamienne zwiększenie (p<0,05) liczby pałeczek kwasu mlekowego w naczyniu 2 (pH 6.5), który został zachowany do osiągnięcia stanu stacjonarnego. Liczba bifidobakterii pozostała stabilna. Natomiast clostridia zmniejszyła się znacząco (P<0,01) w obu naczyniach i całkowicie zniknęła ze naczynia 1 (pH 5,2) w stanie stacjonarnym. Podobne zmniejszenie (p <0,05) obserwowano dla E. coli w naczyniu 1 (pH 5,2), ale nie w naczyniu 2 (pH 6,5). Naczynia zawierające α-la i zaszczepione próbkami kału uzyskanymi od 1-i 3-miesięcznych niemowląt miały stabilną liczbę całkowitą, a także poziom innych bakterii (nie wykazano). Po zaszczepieniu fermentatorów próbkami kału uzyskanymi od 6-miesięcznych niemowląt (Fig. 3), liczba całkowita i liczba bakterii kwasu mlekowego pozostały niezmienione. Liczba bakterii Bacteroides, clostridia i E. coli zmniejszyła się zauważalnie po zrównoważeniu i statystycznie istotne zmniejszenie (P< 0,05) obserwowano przy obu poziomach pH. Naczynia zawierające GMP i zaszczepione próbkami kału od 1-i 3-miesięcznych niemowląt wykazywały całkowitą liczbę bakterii Bacteroides i E. coli, które wahały się, ale pozostały stabilne. Podobnie jak w przypadku α-la, lactobacilli wykazywały niewielką tendencję wzrostową w porównaniu z próbkami początkowymi, ale nie obserwowano istotności statystycznej (nie wykazano). Gdy fermentatory zostały zaszczepione kałem od 6-miesięcznych niemowląt (rys. 3), liczba całkowita, lactobacilli i bifidobacteria pozostały niezmienione. Liczba bakterii Bacteroides, clostridium i E. coli zmniejszyła się zauważalnie po osiągnięciu równowagi, a statystycznie istotne zmniejszenie (P<0,05), podobne do obserwowanego w przypadku formuły uzupełnionej α-la, obserwowano przy obu poziomach pH.

3

średnia liczba bakterii w naczyniach inokulum i fermentora (log10) zawierających α-la lub GMP z wykorzystaniem kału 6-miesięcznych dawców. Wyniki są średnią (log10 na g masy mokrej)±S. D. N=inokulum z kału; V1TS=naczynie 1 w stanie ustalonym (pH 5,2); V2TS=naczynie 2 w stanie ustalonym (pH 6,5).

3

średnia liczba bakterii w naczyniach inokulum i fermentora (log10) zawierających α-la lub GMP z wykorzystaniem kału 6-miesięcznych dawców. Wyniki to średnia (log10 na G mokrej masy)±S. D. N=inokulum z kału; V1TS=naczynie 1 w stanie stacjonarnym (pH 5,2); V2TS=naczynie 2 w stanie ustalonym (pH 6,5).

3, 3 kwasy organiczne

całkowita ilość kwasów organicznych różniła się istotnie statystycznie (P<0, 05) pomiędzy inokulą a czasem próby, przy czym średnia całkowita ilość kwasu dla inokuli wynosiła 4, 28 mmol l−1, 8, 16 mmol L−1 i 15, 64 mmol L−1 w porównaniu do 73, 80 mmol/l−1 (zakres 18, 93–160, 49), 39, 29 mmol L−1 (Zakres 15, 30–100, 28) i 80, 49 mmol l−1 (Zakres 28, 07–177, 34) odpowiednio u dawców w wieku 1, 3 i 6 miesięcy. Błędy standardowe były 4.96%, 3.10%, 2.61%, 1.80%, 0.91%, 0.84%, 1.91% i 5.12% odpowiednio dla octanu, propionianu, i-maślanu, N-maślanu, i-walerianianu, N-walerianianu, kapronianu i mleczanu. Octan był kwasem dominującym we wszystkich grupach (Fig. 4) Następnie mleczan i propionian, średnio 63%, 21%, 11% całkowitego kwasu odpowiednio. D ( – ) – Mleczan stwierdzono głównie w porównaniu z L (+)-mleczanem, który występował sporadycznie i w minimalnych ilościach. Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic pomiędzy grupami badanymi dla izoacydów, walerianów i kapronianów, które występowały w ilościach śladowych.

4

średnie względne ilości (%) kwasu w zbiornikach fermentacyjnych. Diety: N=inokulum; a-la (α-la)=α-laktoalbumina; GMP=glikomakropeptyd; BM = mleko matki. Wiek dawcy: 1 = 1 miesiąc; 3=3 miesiące; 6=6 miesięcy po urodzeniu.

4

średnie względne ilości (%) kwasu w zbiornikach fermentacyjnych. Diety: N=inokulum; a-la (α-la)=α-laktoalbumina; GMP=glikomakropeptyd; BM = mleko matki. Wiek dawcy: 1 = 1 miesiąc; 3=3 miesiące; 6=6 miesięcy po urodzeniu.

była jednak statystycznie istotna różnica (P<0.05) pomiędzy grupami dla względnych ilości głównych kwasów i N-maślanu. Octan i mleczan występowały zwykle w stosunku 3:2, z wyjątkiem inokulum 6-miesięcznego niemowlęcia, w którym przeważał mleczan (P<0,01). stężenia N-maślanu na ogół zwiększały się wraz z wiekiem dawcy, podczas gdy propionian zmniejszał się, aż oba stężenia były w przybliżeniu równe. Niewielkie ilości i-maślanu stwierdzono również we wszystkich grupach wiekowych dawców, a także w grupie mleka matki.

4 dyskusja

na podstawie wcześniejszych badań powszechnie uważa się, że niemowlęta karmione piersią mogą korzystać z mikrobioty, która jest liczebnie zdominowana przez bifidobakterie i / lub pałeczki kwasu mlekowego . wcześniej stwierdzono, że α-La i GMP znacząco stymulują wybrane czyste Kultury bifidobakterii in vitro. Jednak podobnych wyników nie zaobserwowano tutaj w kulturze mieszanej. We wstępnych hodowlach wsadowych zaszczepionych DOROSŁYM materiałem odchodowym nie zaobserwowano statystycznie istotnego wpływu na korzystną mikroflorę. Podobnie było w przypadku obu suplementów stosowanych w hodowli ciągłej zaszczepionej materiałem odchodowym od niemowląt w różnych grupach wiekowych. Pomimo tego, bifidobakterie były dominującą grupą zarówno w formułach testowych, jak i kontroli mleka matki, gdzie bifidobakterie również pozostawały na stałym poziomie przez cały eksperyment. Głębszy efekt zaobserwowano w przypadku pałeczek kwasu mlekowego. Mleko matki znacznie zwiększyło liczbę bakterii mlekowych. Wykazano niewielki, ale statystycznie nieistotny wzrost liczby pałeczek kwasu mlekowego w kale 3-miesięcznych niemowląt, tendencja ta utrzymywała się w eksperymentach z użyciem materiału z kału u 6-miesięcznych niemowląt.

oba suplementy formuły są również uważane za posiadające pewien wpływ hamujący na różne patogeny. Wcześniej wykazano, że GMP ma kilka atrybutów przeciw chorobotwórczych zarówno w łańcuchu węglowodanowym zawierającym kwas N-acetylneuraminowy (kwas sialowy), jak i w jego części polipeptydowej . Obecność kwasów sialowych na powierzchni komórek jelitowych jest często wymagana do infekcji różnych patogenów jelitowych, a egzogenne źródło GMP może hamować adhezję bakterii, która jest niezbędna do infekcji. Kawakami wykazał to poprzez hamowanie przylegania enteropatogennych E. coli do ludzkich linii komórkowych jelit. Na ogół stężenie składników zawierających kwas sialiczny jest wyższe w mleku ludzkim niż w preparatach dla niemowląt. Hamujący wpływ GMP na Bacteroides, clostridia i E. coli, trzy potencjalnie patogenne organizmy, zaobserwowano w tym badaniu. Podczas gdy we wstępnych hodowlach wsadowych wykorzystujących liczbę dorosłych odchodów na ogół zachowano tendencję spadkową w hodowli ciągłej. Statystycznie znamienną redukcję tych organizmów stwierdzono jednak tylko w hodowlach z kałem 6-miesięcznego niemowlęcia. Podobne wyniki zaobserwowano w mleku matki, które znacznie zmniejszyło stężenie clostridia i E. coli, podczas gdy Bacteroides pozostały niezmienione. Natomiast podłoże bazalne znacznie zwiększyło poziom Bacteroides pokazując, że zmiany w składzie flory nie były wynikiem wypłukiwania, ale zależały od podłoża fermentacyjnego.

α-La, Składnik regulacyjny syntazy laktozy, ma wysoki poziom identyczności sekwencji z lizozymami typu c i ma podobną trójwymiarową strukturę sugerującą, że pochodzą one ze wspólnego genu przodków . Przeprowadzono kilka badań sugerujących, że α-la może mieć podobny wpływ na patogeny . Natomiast Pelligrini et al. okazało się, że trawienie proteolityczne przez trypsynę i pepsynę daje trzy peptydy o właściwościach bakteriobójczych, głównie aktywnych przeciwko organizmom Gram-ujemnym. Właściwości bakteriostatyczne hydrolizowanego α-la obserwowano specjalnie dla E. coli. W badaniu tym zaobserwowano hamujący wpływ α-la Na Bacteroides, clostridia i E. coli. Ponownie statystycznie istotne zmniejszenie tych organizmów wykryto tylko w hodowlach z kałem u 6-miesięcznych niemowląt, wynik porównywalny z wynikiem uzyskanym w przypadku kontroli mleka matki.

nasze badanie potwierdziło, że octan był głównym SCFA u karmionych piersią w porównaniu do niemowląt karmionych butelką wraz z niskimi stężeniami propionianu i prawie całkowitym brakiem maślanu w pierwszych 117 dniach życia . Mleczan i octan zwykle występują w stosunku 2: 3, co potwierdza dominującą rolę bifidobakterii w mikroflorze, jak opisano przez Rasic i Kurmann . Wysoka częstość występowania mleczanu jest również typowa dla niepełnej lub szybkiej fermentacji, Zwykle związanej z kwaśnym pH, jak widać u karmionych piersią dzieci . Nie zostało to jednak tutaj potwierdzone, ponieważ inokulum kału dawców karmionych piersią fermentujących mleko matki wytworzyło profil kwasowy prawie całkowicie pozbawiony mleczanu. Z drugiej strony, próbki kału fermentujące formułę uzupełnioną α-la i GMP wytworzyły profil kwasowy charakterystyczny dla fermentacji formuł z wyższymi stężeniami N-maślanu, które zwiększały się wraz z wiekiem dawcy . Jednakże octan nadal pozostawał dominujący u niemowląt karmionych wyłącznie piersią.

podsumowując, wykazaliśmy mikrobiologiczne efekty suplementacji preparatów dla niemowląt α-la i GMP. W porównaniu z wcześniejszymi badaniami in vitro z użyciem czystych kultur bifidobakterii, nie zaobserwowano bifidogennego działania obu suplementów przy użyciu inokuli kałowej. Zaobserwowano jednak statystycznie istotne zmniejszenie potencjalnie patogennej mikroflory, podobne do obserwowanego u niemowląt karmionych piersią. Tak więc, w tym kontekście, można stwierdzić, że suplementacja α-la i GMP w połączeniu z dużymi ilościami octanu ma korzystny wpływ na ludzką mikroflorę.

podziękowania

naukowcy chcieliby podziękować Pani Alethea Hill, a także darczyńcom i ich rodzicom za wsparcie, entuzjazm i nieocenioną pomoc w badaniu.

Borriello
S. P.

(

1986

)

flora bakteryjna przewodu pokarmowego

. W:

metabolizm drobnoustrojów w przewodzie pokarmowym

(

Hill
M. J.

, Wyd.), pp.

2

16

.

CRC Press

,

Boca Raton, FL

.

von Sonnenborn
I

Stobernak
CZ.-P.

Proppert
Y.

(

1990

)

rozwój beztlenowej mikroflory jelitowej u noworodków

.

postęp. Miód.
108

,

420

424

.

Mitsuoka
T.

(

1995

)

Comparative intestinal microbial ecology and metabolism in man and animals

. W:

medyczne i stomatologiczne aspekty beztlenowców

(

Durden
B. I.

Wade
VG

Grill
J.S.

Eli
A.

Ren
B.

Hudson
MJ.

, red.), str.

87

107

.

przeglądy Naukowe

.

Harmsen
HJM.

Wildborough-Veloo
A. K. M.

Raangs
G. S.

i in. (

2000

)

analiza rozwoju flory jelitowej u niemowląt karmionych piersią i karmionych mlekiem modyfikowanym przy użyciu technik identyfikacji molekularnej i wykrywania

.

J.w. Pediatra. Gastroenterol. Nutr.
30

,

61

67

.

Salminen
s.

Bule
s.

Butron-ruo
m.-s.

i in. (

1998

)

nauka o żywieniu funkcjonalnym oraz fizjologia i funkcja przewodu pokarmowego

.

br. J. Nutr.
80

,

S147

S171

.

Harmsen
HJM.

Gibson
RR

i wsp. (

1999

)

porównanie liczby wykonalnych komórek i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ przy użyciu specyficznych sond opartych na rRNA do ilościowego oznaczania ludzkich bakterii kałowych

.

Mikrobiol FEMS. Litera.
183

,

125

129

.

Macfarlane
RT

Gibson
R.

Macfarlane
s.

(

1994

)

produkcja krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i mleczanów przez ludzkie bakterie jelitowe hodowane w hodowli okresowej i ciągłej

. W:

krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe

(

spoiwo
HJ

Cummings
J.w.X.

Soergel
K. X.

, red.), str.

44

60

.

Wydawnictwo Kluwer

,

Londyn

.

Allison
s.

Macfarlane
s.

Macfarlane
gt

(

1989

)

badania mieszanych populacji ludzkich bakterii jelitowych hodowanych w jedno – i wieloetapowych systemach ciągłej hodowli

.

aplikację. Ok. Mikrobiol.
55

,

679

683

.

Marsz
P.

(

1995

)

rola kultury ciągłej w modelowaniu ludzkiej mikroflory

.

J.w. Chim.. Tech. Biotechnologia.
64

,

1

9

.

Weye
BG
Rowland
I.

(

1981

)

Symulacja ekosystemu jelit szczura przy użyciu dwustopniowego system ciągłego kultury

.

J.w. Generał. Mikrobiol.
123

,

103

115

.

Macfarlane
RT

Macfarlane
s.

Gibson
RR

(

1998

)

weryfikacja trzystopniowego złożonego systemu ciągłej hodowli w celu zbadania wpływu czasu retencji na ekologię i metabolizm bakterii w ludzkiej okrężnicy

.

mikrob. Ekol.
35

,

180

187

.

Edwards
C. A.

Парретт
am

Ballmer
S. E.

Wharton
Ba

(

1994

)

Kału kwasy tłuszczowe o krótkim łańcuchu u dzieci, karmione i karmionych

.

Akt pediatrii.
83

,

459

462

.

Cummings
J.X.

(

1983

)

fermentacja w ludzkim jelicie grubym: dowody i konsekwencje zdrowotne

.

Lancet
1

,

1206

1208

.

Midtvedt
T.

Karlstedt-Duke
B.

Hoverstad
T.
1986

)

wpływ doustnego leku przeciwdrobnoustrojowego na aktywność biotransformatora mikroflory jelitowej u zdrowego osobnika

.

hebr. J. Mrugnięcie. Inwestować.
16

,

11

17

.

x.

(

1997

)

Biological significance of sialic acid-containing substances in milk and their application

.

Recent Res. Dev. Agric. Biol. Chem.
1

,

193

207

.

Idota
T.

Kawakami
H.

Nakajima
I.

(

1994

)

Growth-promoting effects of N-actelylneuraminic acid containing substances on bifidobacteria

.

Biosci. Biotechnol. Biochem.
58

,

1720

1722

.

Buchallab
s.

Favreau
s.

Mobua
Jl

(

1993

)

aktywność stymulująca wzrost tryptycznego trawienia kazeinomakropeptydu dla Lactococcus lactis ssp. lactis

.

mleko
73

,

73

77

.

Xue
YU

Louis
J.N.

Słońce
z.

Matowy
z.

Wu
z.

Zhu
D.

(

2001

)

Mutant α-Laktalbuminy działający jako lizozym

.

struktura białek. Funkcjonować. Genet.
42

,

17

22

.

Pihlanto-Lappiala
A.

Marnila
P.

Hubert
L.

Rocca
t.

Korhonen
HJT.

Karpal
M.

(

1999

)

wpływ hydrozylanów α-laktalbuminy i β-laktalbuminy na aktywność metaboliczną Escherichia coli JM103

.

J.w. Aplikacja. Mikrobiol.
87

,

540

545

.

Petshaw
BV
Talbott
D.

(

1991

)

reakcja gatunków bifidobakterii na stymulanty wzrostu w mleku ludzkim i krowim

.

pediatra. Rez.
29

,

208

213

.

Franks
Ah

Harmsen
HJM.

Raangs
G. S.

i in. (

1998

)

zmiany populacji bakterii w ludzkim kale mierzone metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z sondami oligonukleotydowymi ukierunkowanymi na 16S rRNA specyficzne dla grupy

.

aplikację. Ok. Mikrobiol.
64

,

3336

3345

.

Niser
J.R.

Golliard
M.

Volz
A.

Ruve
M.

Dillmann
M. L.

Guggenheim
B.

(

1994

)

modulatorem adhezji bakterii jamy ustnej do śliny in vitro są granulki hydroksypatytu pokryte pochodnymi kazeiny Mlecznej

.

Mikrobiol jamy ustnej. Immunol.
9

,

193

201

.

Wold
AE
Adlerbert
I.

(

2000

)

karmienie piersią i mikroflora jelit niemowlę – konsekwencje dla ochrony od chorób zakaźnych

. W:

krótko-i długoterminowe skutki karmienia piersią dla zdrowia dzieci

(

Kielecko
B.

i in., red.).

Wydawnictwo Kluwer Academic / Plenum Publishers

,

Nowy Jork

.

Pelligrini
A.

Thomas
U.

Bramaz
N.

Hunziker
N.

von Fellenberg
R.

(

1999

)

izolacja i identyfikacja trzech domen bakteriobójczych w cząsteczce Alfa-laktalbuminy w encefalopatii

.

Biochim. Biofizyk. Akt
1426

,

439

448

.

Siigur
U.

Ormisja
A.

Tamm
A.

(

1993

)

krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe w kale u niemowląt karmionych piersią i karmionych mlekiem modyfikowanym

.

Akt pediatrii.
82

,

536

538

.

Wolin
MJ

Yerry
s.

Miller
T. L.

Zhang
YU

Bank
s.

(

1998

)

zmiany w produkcji etanolu, kwasów i H2 z glukozy przez florę kałową niemowlęcia karmionego piersią w wieku od 16 do 158 dni

.

J.w. Nutr.
128

,

85

90

.

Rasic
J.L.

Kurmann
J.A.

(

1983

)

bifidobakterie i ich rola .

Birkhauser Verlag

,

Basel

.

Tianan
J.

Savaiano
da

(

1997

)

Edycja fermentacji okrężnicy przez bifidobakterie i pH in vitro

.

wykop. Dziesięciu. Wiedza.
42

,

2370

2377

.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.