gebruik van batchculturen en een tweetraps continucultuursysteem om het effect van aanvullend α-lactalbumine en glycomacropeptide op gemengde populaties van menselijke darmbacteriën

Abstract

bepaalde melkfactoren kunnen de groei van een gastheervriendelijke gastro-intestinale microflora bevorderen. Dit kan verklaren waarom zuigelingen die borstvoeding krijgen minder darminfecties ervaren dan hun tegenhangers die borstvoeding krijgen. Het effect van suppletie met twee van deze factoren werd in deze studie onderzocht. Fecale monsters voor zuigelingen werden gebruikt voor het fermenteren van formules aangevuld met glycomacropeptide en α-lactalbumine in een tweestaps compound continue culture model. Bacteriologie werd bepaald door fluorescentie in situ hybridisatie. Vaten met zowel moedermelk als α-lactalbumine en glycomacropeptide vertoonden stabiele tellingen van bifidobacteriën, terwijl lactobacillen alleen significant toenamen in vaten met moedermelk. Bacteroides, clostridia en Escherichia coli namen in alle runs significant af. De Acetaat was het belangrijkste zuur dat samen met hoge hoeveelheden propionaat en lactaat wordt gevonden. Aanvulling van zuigelingenvoeding met geschikte melkeiwitten kan nuttig zijn bij het simuleren van de gunstige bacteriologische effecten van moedermelk.

1 Inleiding

de menselijke dikke darm is een complex ecosysteem dat een breed scala aan bacteriën herbergt. Ten minste 400 verschillende bacteriesoorten worden verondersteld aanwezig te zijn op een bepaald moment, met maximaal 1012 bacteriën gevonden per G feces . De microflora worden verkregen bij de geboorte, waarbij de steriele pasgeborene wordt gekoloniseerd door verschillende bacteriën tijdens het leveringsproces . Tijdens de eerste levensdagen overheersen vanuit voedingsoogpunt niet veeleisende prokaryoten zoals enterobacteriën, stafylokokken en streptokokken (waaronder enterokokken). Binnen de eerste week van het leven, worden de geslachten zoals bifidobacteria en Bacteroides gevestigd . Men denkt dat de borst-gevoede zuigelingen een darmflora hebben die numeriek door bifidobacteriën wordt gedomineerd, terwijl zij die formule-gevoed zijn complexere microbiota hebben die in samenstelling aan die van volwassenen gelijkaardig zijn . Bifidobacteriën kunnen krachtige anti-microbiële effecten uitoefenen tegen een verscheidenheid aan intestinale pathogenen zoals bepaalde Enterobacteriaceae en Clostridium spp. Als zodanig, wordt een overwicht van bifidobacteriën gezien als één indicator van verbeterde darmgezondheid . Waarnemingen van de normale darmflora zijn grotendeels afgeleid van kwantitatieve plaatkweek en fenotypische karakterisering, die beperkingen hebben in termen van terugwinningsefficiëntie en subjectiviteit van de toediener .aangezien het proximale colon fysiek ontoegankelijk is voor routinematige doeleinden, zijn bovendien de meeste microbiële studies over fermentatie uitgevoerd met fecale bacteriën in batchculturen of single-stage chemostatica . Batchcultuur maakt het mogelijk de fermenteerbaarheid van verschillende substraten gedurende korte perioden (24 uur) te bepalen. Er bestaan echter duidelijke verschillen in substraatbeschikbaarheid en omgevingsomstandigheden tussen de proximale en distale dikke darm, die niet in een enkel vatsysteem kunnen worden gesimuleerd .

daarentegen hebben in-vitro-systemen die gebruik maken van meerdere in serie uitgelijnde fermentatievaten voordelen doordat ze complexere omgevingsomstandigheden kunnen modelleren en tegelijkertijd ruimte-en temporele heterogeniteit mogelijk maken . Zo werd aangetoond dat een chemostaat in twee fasen met celrecycling van de tweede tot de eerste fase bevredigende resultaten oplevert . Verdere verfijning voor het modelleren van de volwassen menselijke dikke darm werd uitgevoerd door Macfarlane et al. met behulp van een drietraps compound continu culture systeem. Dit werd microbiologisch gevalideerd tegen menselijk dikke darm materiaal verkregen van plotselinge dood slachtoffers bij autopsie. Dergelijke modellen zijn waardevol voor het bestuderen van de darm microflora aangezien verschillende fysisch-chemische voorwaarden kunnen worden gecontroleerd. Dit heeft duidelijke economische voordelen, maar is vooral relevant voor het plannen van menselijke studies.

verschillen in de fecale flora worden ook weerspiegeld in variërende lactaat -, korte-(SCFA) en vertakte vetzuurpatronen die tussen-en eindproducten zijn van bacteriële fermentatie . Hun productiesnelheid en fermentatiepatroon kunnen ook worden bepaald door de beschikbaarheid van substraten voor de darmflora . Daarom kunnen veranderingen in de fecale flora van een verandering in voeding, of antimicrobiële therapie, ook leiden tot een verandering in de fermentatiepatronen en de concentratie van organisch zuur . De hoeveelheid van dergelijke zuren geproduceerd bij mensen is moeilijk te bepalen en slechts een klein aantal studies zijn uitgevoerd die erop wijzen dat bij volwassenen dagelijks tussen 300 mmol en 1-2 mol zuur wordt geproduceerd. Acetaat bleek in alle gevallen het belangrijkste geproduceerde SCFA te zijn en er zijn aanwijzingen dat de caecale SCFA-concentraties ongeveer het dubbele zijn van die in het recto-sigmoid gebied .

twee melkbestanddelen hebben eerder aangetoond dat ze in vitro gastro-intestinale infecties remmen en/of bifidobacteriën stimuleren. Glycomacropeptide (GMP), een derivaat van κ-caseïne, is in vitro uitgebreid bestudeerd en bleek de hechting van bacteriën, virussen en toxines aan het celmembraan te remmen door binding aan de receptorplaatsen van het pathogeen . Deze in vitro tests toonden ook aan dat GMP de groei van Bifidobacterium breve, B. bifidum, B. infantis en Lactococcus lactis sterk bevorderde. van α-lactalbumine (α-la), dat een tertiaire structuur heeft die vergelijkbaar is met C-type lysozymes, is aangetoond dat het vergelijkbare effecten heeft . Pihlanto-Leppälä et al. eerder bleek dat α-la de metabole activiteit van Escherichia coli JM103 verminderde tot slechts 21% van de normale activiteit. Bovendien toonde het testen van gezuiverde koemelk aan dat α-la een krachtige groeibevorderaar was voor B. infantis en B. breve.

in deze studie hebben we gebruik gemaakt van batchculturen en een tweefasig compound continu culture systeem om fermentatieeigenschappen en bacteriële activiteiten te testen na toevoeging van zuigelingenvoeding met α-la en GMP. Het continuous culture systeem werd aangepast van het drietraps model ontwikkeld door Macfarlane et al. . Het kleinere bedrijfsvolume en de snellere omzet probeerden rekening te houden met de fysieke factoren die bij menselijke zuigelingen worden aangetroffen. We hebben getest of suppletie van α-la en GMP de gastro-intestinale flora kan veranderen om vergelijkbare voordelen te bieden als die waargenomen bij zuigelingen die borstvoeding krijgen.

2 Materialen en methoden

2.1 Batchcultuur

voor de anaerobe batchcultuursystemen bevat het basale kweekmedium (per liter): 1 g pepton, 1 g gistextract, 0,05 g NaCl, 0,02 g K2HPO4, 0,02 g KH2PO4, 0,005 g MgSO4·7H2O, 0,005 g CaCl2·6H2O, 1 g NaHCO3, 1 ml Tween 80, 0.0025 g haemin, 5 µl vitamine K1, 0,25 g cysteïne HCl en 0,25 g galzouten opgelost in 500 ml gedeïoniseerd water, ingesteld op pH 7,0 en gesteriliseerd door autoclaaf. Alle chemicaliën zijn verkregen van Sigma (Poole, Dorset, UK), tenzij anders vermeld. Steriel medium (50 ml) werd geplaatst in flessen van 100 ml batchcultuur met 0,5 g (1% G/v) van een testformule (Arla Foods Ingredients, Viby, Denemarken) aangevuld met α-la (68% g/v) of GMP (80% G/v) en onder een atmosfeer van zuurstofvrij stikstofgas gehouden. De formules werden vergeleken met een standaard met 1% (M/M) lactose. De volgende dag werd een vers fecaal monster verzameld in een stomacherzak en onmiddellijk verwerkt. Het experiment werd vijf keer herhaald met vijf verschillende donoren.

De batchkweekvaten werden geïnoculeerd met 5 ml van een 10% (g/v) fecale slurry van gezonde volwassen vrijwilligers bereid met anaërobe fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 0,1 M, pH 7,2) en 1 ml monsters werden genomen op keer 0 (voordat het monster in batchkweek werd geplaatst), 6 uur en 24 uur en bewaard bij 4°C tot verder gebruik. Voor het tellen van bacteriën door fluorescerende in situ hybridisatie (FISH) werd 375-µl triplicaten van het verzamelde monster verwijderd en toegevoegd aan een 1,5-ml Eppendorf-buis met 1125 µl met filter gesteriliseerd 4% (G/v) paraformaldehyde in PBS (pH 7,2) en gedurende ten minste 4 uur bij 4°C. Het vaste monster werd vervolgens gedurende 5 minuten bij 13 000×g gecentrifugeerd en het supernatans weggegooid. De pellet werd geresuspendeerd in 1 ml gefilterd PBS (pH 7,4) met 0,00001% (g/v) cetyltrimethylammoniumbromide en overgebracht naar een Eppendorf-buis voor afstoting (13 000×g, 5 min). Nadat de pellet een tweede keer was gewassen, werd het supernatant verwijderd en werd de pellet grondig geresuspendeerd in 150 µl gefilterd PBS en 150 µl ethanol van 96% (v/v). Het monster werd goed gemengd en gedurende ten minste 1 uur bij -20°C bewaard vóór hybridisatie met een fluorescerende sonde (zoals hieronder beschreven).

2.2 tweetraps continue kweeksysteem

het continue kweeksysteem bestond uit twee glazen vaten, V1 en V2, beide met een werkvolume van 100 ml. Temperatuur (37°C) en pH werden automatisch geregeld. Kweek pH in de vaten was 5.2 in V1, wat de lage pH-omgeving van het proximale colon en 6,5 in V2 weergeeft, wat wijst op een meer neutrale pH in het distale colon. Elke fermentor werd magnetisch geroerd en het groeimedium werd continu gevuld met zuurstofvrije stikstof (15 ml min-1) en vanuit een glazen medium reservoir door een peristaltische pomp (Watson−Marlow, Falmouth, UK) naar V1 gevoerd. V1 sequentieel geleverd V2 via een overloop en een reeks stuwen. De overloop van V2 werd geleid naar een afvalcontainer. Het kweekmedium bestond uit (A) het hierboven beschreven basale medium met toevoeging van 1% (m/v) lactose (Sigma, Poole, Dorset, UK), (B) moedermelk (verstrekt door Royal Berkshire Hospital, Reading, UK) met toevoeging van 0,5 g l−1l-cysteïne-HCl, (C) testformule met 68% (m/v) α-la−supplement, 1% (m/v) lactose en 0,5 g l-1l-cysteïne−HCl, en (D) testformule met 68% (m/v) GMP, 1% (G/V) lactose en 0,5 g l-1l-cysteïne-hcl. Alle formules werden verkregen uit Arla Foods Ingredients (Viby, Denemarken) en gepredigeerd met pepsine (575 u per g eiwit) bij pH 2 gedurende 2 uur (37°C), gevolgd door pancreatine (50 U per g eiwit) en 0,5 g L−1 volume galzuur bij pH 6,5 gedurende 2 uur (37°C). Om anaerobiciteit te garanderen, werd 4 ml l−1 van een 250 mg L−1 stamoplossing van resazurine gekookt en aan het medium toegevoegd. De media werden vervolgens gedurende 20 min tot 80°C verwarmd, ‘ s nachts tot kamertemperatuur afgekoeld en nog eens 20 min tot 80°C verwarmd alvorens continu met O2-vrij N2 te worden afgevoerd. Het systeem werd in werking gesteld met een retentietijd (R) van 12 uur, berekend als de reciproke verdunningssnelheid. Systeemretentietijd vormde de som van individuele R-waarden in elke fermentor. Elke fermentor werd geïnoculeerd met 15 ml verse 10% (g/v) fecale drijfmest van gezonde zuigelingendonoren tussen de leeftijd van 1 en 6 maanden en gevoed met moedermelk met supplementaire formule. De mengmest werd bereid met anaërobe 0,1 M PBS (pH 7,2). Alle experimenten werden vijfmaal herhaald met verschillende donoren, met uitzondering van groep B (moedermelk), waar het experiment eenmaal werd uitgevoerd met het fecale materiaal van een 3 maanden oude, uitsluitend borstvoeding gevende donor. De groepen C en D bevatten elk vijf verschillende individuen. Monsters werden genomen na de leeftijd van 1, 3 en 6 maanden om eventuele verschillen in de fecale microflora en eventuele veranderingen in de effectiviteit van supplementen te beoordelen naarmate de zuigelingen rijpen. Het fermentatiesysteem werd toegestaan om ‘ s nachts te equilibreren voordat de medium pomp werd gestart, en werd gedurende ten minste 144 uur uitgevoerd om steady state omstandigheden vast te stellen. 3 ml monsters van het oorspronkelijke entmateriaal (N), na equilibratie (T0) en bij steady-state (TS), werden genomen en bereid voor de analyse van vissen zoals hierboven beschreven.

2.3 bacterietelling door middel van vis

Oligonucleotidesondes (Tabel 1) Voor Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp./ Enterococcus, Bacteroides spp. , Clostridium histolyticum group and E. coli werden aan het einde van 5′ gesynthetiseerd en monolabeld met Cy3 (Ex 552 nm, Em 568 nm) door Eurogentec (Abingdon, UK) of MWG-Biotech (Milton Keynes, UK). Hybridisatie vond Overnacht plaats bij 50°C voor Bifidobacterium en Clostridium, bij 45°C voor Lactobacillus en Bacteroides en bij 37°C voor E. coli. Voor hybridisatie werd 200 µl gefilterde buffer (40 mM Tris−HCl pH 7,2, 1,8 M NaCl) met 20 ml L−1 van 10% (g/v) SDS en 64 µl water van HPLC-kwaliteit toegevoegd aan 16 µl vaste cellen en opgewarmd tot de juiste temperatuur. Prewarmed hybridisatieoplossing (90 µl) werd toegevoegd aan 10 µl van de desbetreffende sonde (eindconcentratie 50 ng µl−1) en de oplossing werd ‘ s nachts geïncubeerd in een hybridisatie-oven. Voor de E. coli-sonde werd 264 µl hybridisatiebuffer met 35% (v/v) formamide toegevoegd aan 16 µl vaste cellen. De cellen werden gewassen door toevoeging van 5 ml wasbuffer (20 mM Tris–HCl pH 7,2, 0,9 M NaCl) aan 5-100 µl gehybridiseerd Monster, gekleurd met 20 µl 4’,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, Ex 344, Em 450; 500 ng ml−1) en gedurende 30 minuten geïncubeerd in een hybridisatie-oven. Voor de totale tellingen werd 5-12 µl van het monster vacuüm gefilterd op een 0,2-µm poriegrootte polycarbonaatfilter (Millipore, Watford, UK) en op een microscoopglaasje geplaatst. Om te voorkomen dat de sondes vervagen, werd één druppel SlowFade-Light Antifade Kit component a (Molecular Probes Europe, Leiden, Nederland) aan het filter toegevoegd. De dia ‘ s werden microscopisch onderzocht met behulp van een Epi-fluorescentie bijlage (Nikon UK, Kingston upon Thames, UK). UV-licht werd gebruikt om DAPI-bevlekte bacteriën te tellen en Cy3-bevlekte cellen werden geteld bij 550 nm. Vijftien willekeurige velden met een goede verdeling van cellen (10-100) werden geteld voor elke sonde en monster.

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

2.4 Volatile acid analysis

Undiluted aliquots (1.0 ml) monster werd in buisjes van 1,5 ml Eppendorf toegediend en gecentrifugeerd (13 000×g, 5 min) aan pelletbacteriën en andere vaste stoffen. Het supernatant werd vervolgens gefilterd met behulp van een 0,2-µm polycarbonaatfilter en toegevoegd aan vier delen acetonitril met 4,3 mmol L−1 van 2-ethylboterzuur als interne standaard. Kalibratie werd uitgevoerd met standaardoplossingen van azijnzuur, propionzuur, I-boterzuur, n-boterzuur, I-valeriaanzuur, n-valeriaanzuur, n-caproïnezuur en dl-melkzuur in acetonitril. De vetzuren werden bepaald door gas-vloeistofchromatografie op een Agilent 6890-serie GC-systeem (Agilent, Waldbronn, Duitsland) met een Optima ffap-kolom (25 m×0,32 mm, Macherey-Nagel, Düren, Duitsland) en een vlamionisatiedetector. Het dragergas helium werd geleverd met een debiet van 1,8 ml min-1. Injector, kolom, en detector werden ingesteld op 220°C, 140°C (Isotherm), en 220°C, respectievelijk. Na 5 minuten werd de kolomtemperatuur verhoogd tot 240°C bij 20°C min−1 stappen om nog eens 15 minuten te lopen. Peaks werden geà ntegreerd met behulp van een PC waarop Atlas Lab managing software draait (Thermo Lab Systems, Mainz, Duitsland). De vetzuurconcentraties werden berekend door hun piekoppervlakte te vergelijken met die van de interne standaard en werden uitgedrukt in millimolen per liter.

2.5 statistische analyse

statistische analyse werd uitgevoerd met eenrichtingsanova (entmateriaal, versus steady-state, TS) voor het bepalen van de significantie bij P<0,05, tenzij anders vermeld.

3 Resultaten

3.1 Batchcultuur

vóór de inoculatie bevatten de monsters bijna identieke aantallen Bifidobacterium spp., Bacteroides spp., en Clostridium spp. Lactobacillen waren minder talrijk. In culturen die α-la bevatten (Fig. 1), de totale tellingen, bifidobacteriën, clostridia, lactobacilli en Bacteroides bleven onveranderd. Het aantal E. coli nam significant af (P<0,01) met α-la-suppletie na 6 uur incubatie, maar nam weer toe tot de uitgangswaarden (niet aangetoond).

1

gemiddelde bacterietellingen (log10) in volwassen fecale entmateriaal en batchculturen met basaal medium met 1% (M/M) lactose) of 1% (M/M) testformule. De resultaten zijn gemiddelden (log10 per G nat gewicht)±S. D. N = fecaal entmateriaal; 24 uur, lactose = cultuur na 24 uur incubatie met lactose; 24 uur, a-la/GMP = cultuur na 24 uur incubatie met α-la of GMP.

1

gemiddelde bacterietellingen (log10) in volwassen fecale entmateriaal en batchculturen met basaal medium met 1% (M/M) lactose) of 1% (M/M) testformule. De resultaten zijn gemiddelden (log10 per G nat gewicht)±S. D. N = fecaal entmateriaal; 24 uur, lactose = cultuur na 24 uur incubatie met lactose; 24 uur, a-la/GMP = cultuur na 24 uur incubatie met α-la of GMP.

culturen die GMP bevatten (Fig. 1) over het algemeen gehandhaafd aantal bifidobacteriën, Bacteroides, lactobacilli en clostridia. Het aantal E. coli nam significant af (P<0,05) na 6 uur incubatie, maar nam opnieuw toe tot basale niveaus (niet aangetoond).

3.2 bi-traps compound continu culture system

In vaten met hetzelfde standaardmedium (basaal medium met 1% M/M lactose, Fig. 2), het totaal aantal bacteriën, bifidobacteriën, lactobacillen en clostridia bleef constant. Bacteroides daarentegen namen significant toe in beide fermentatievaten na evenwicht en bleven hoger dan entmateriaal in steady state in beide vaten (P<0,05). Een statistisch significante afname (P<0,05) kon worden waargenomen voor E. coli in vat 2 (pH 6,5) na equilibratie. Dit werd echter niet gehandhaafd en beide vaten hadden vergelijkbare E. coli-waarden bij steady-state, die lager waren dan het entmateriaal.

2

gemiddelde bacterietellingen (log10) in fecaal entmateriaal en controlefermentvaten met basaal medium dat 1% (M/M) lactose of moedermelk (BM) bevat. De resultaten zijn gemiddelden (log10 per G nat gewicht)±S. D. N=fecaal entmateriaal; V1TS=vat 1 bij steady state (pH 5,2); V2TS=vat 2 bij steady state (pH 6,5).

2

gemiddelde bacterietellingen (log10) in fecaal entmateriaal en controlefermentvaten met basaal medium dat 1% (M/M) lactose of moedermelk (BM) bevat. De resultaten zijn gemiddelden (log10 per G nat gewicht)±S. D. N=fecaal entmateriaal; V1TS=vat 1 bij steady state (pH 5,2); V2TS=vat 2 bij steady state (pH 6,5).

na de vaten met moedermelk (Fig. 2) gedurende 24 uur in evenwicht werden gehouden, werd een statistisch significante toename (P<0,05) waargenomen voor lactobacillen in vat 2 (pH 6.5), die werd gehandhaafd totdat steady state werd bereikt. Het aantal Bifidobacterium bleef stabiel. Clostridia daarentegen nam significant af (P<0,01) in beide vaten en verdween volledig uit vat 1 (pH 5,2) bij steady state. Vergelijkbare dalingen (P<0,05) werden waargenomen voor E. coli in vat 1 (pH 5,2) maar niet in vat 2 (pH 6,5). Vaten met α-la en geïnoculeerd met fecale monsters verkregen van 1-en 3-maanden oude zuigelingen hadden stabiele totale tellingen en niveaus van andere bacteriën (niet aangetoond). Wanneer de fermentoren werden ingeënt met fecale monsters verkregen van zuigelingen van 6 maanden oud (Fig. 3), de totale tellingen en de lactobacilli-tellingen bleven onveranderd. Bacteroides, clostridia en E. coli tellingen namen na equilibratie merkbaar af en bij beide pH-waarden werd een statistisch significante afname (P<0,05) waargenomen. Vaten met GMP en geïnoculeerd met fecale monsters van 1-en 3-maanden oude zuigelingen hadden totale tellingen, Bacteroides en E. coli die fluctueerden maar stabiel bleven. Zoals waargenomen met α-la, vertoonde lactobacilli een lichte opwaartse trend in vergelijking met de initiële monsters, maar statistische significantie werd niet waargenomen (niet aangetoond). Wanneer de fermentoren werden geïnoculeerd met feces van zuigelingen van 6 maanden oud (Fig. 3), de totale tellingen, lactobacillen en bifidobacteriën bleven onveranderd. Bacteroides -, clostridium-en E. coli-tellingen namen na evenwicht merkbaar af en bij beide pH-waarden werd een statistisch significante reductie (P<0,05) waargenomen, vergelijkbaar met die waargenomen met de formule met α-la-aangevuld.

3

gemiddelde bacterietellingen in entmateriaal en fermentatievaten (log10) Die α-la of GMP bevatten met behulp van feces van 6 maanden oude donoren. De resultaten zijn gemiddelden (log10 per G nat gewicht)±S. D. N=fecaal entmateriaal; V1TS=vat 1 bij steady state (pH 5,2); V2TS=vat 2 bij steady state (pH 6,5).

3

gemiddelde bacterietellingen in entmateriaal en fermentatievaten (log10) Die α-la of GMP bevatten met behulp van feces van 6 maanden oude donoren. De resultaten zijn gemiddelden (log10 per G nat gewicht)±S. D. N=fecaal entmateriaal; V1TS=vat 1 bij steady state (pH 5,2); V2TS = schip 2 bij steady state (pH 6,5).

3.3 Organische zuren

het Totaal van de bedragen van organische zuren gevarieerd statistisch significant (P<0.05) tussen de inocula en de sample-tijden met gemiddelde totale zuur voor de inocula worden 4.28 mmol l−1, 8.16 mmol l−1 en 15.64 mmol l−1 in vergelijking met 73.80 mmol/l−1 (bereik 18.93–160.49), 39.29 mmol l−1 (bereik 15.30–100.28) en 80.49 mmol l−1 (bereik 28.07–177.34) voor 1-, 3 – en 6-maand-oude donoren respectievelijk. Standaardfouten waren 4.96%, 3.10%, 2.61%, 1.80%, 0.91%, 0.84%, 1.91% en 5.12% voor respectievelijk acetaat, propionaat, I-butyraat, n-butyraat, I-valeraat, n-valeraat, caproaat en lactaat. Acetaat was het overheersende zuur in alle groepen (Fig. 4) gevolgd door lactaat en propionaat, gemiddeld 63%, 21%, 11% van totaal zuur respectievelijk. d (-)-lactaat werd voornamelijk gevonden in vergelijking met l (+) – lactaat, wat slechts sporadisch en in minimale hoeveelheden voorkwam. Er werden geen statistisch significante verschillen gevonden tussen de studiegroepen voor isozuren, valeraat en caproaat, die optraden in sporenhoeveelheden.

4

gemiddelde relatieve hoeveelheden ( % ) zuur in fermentatievaten. Diëten: N=entmateriaal; a-la(α-la)=α-lactalbumine; GMP=glycomacropeptide; BM = moedermelk. Donorleeftijd: 1 = 1 maand; 3 = 3 maanden; 6 = 6 maanden na de geboorte.

4

gemiddelde relatieve hoeveelheden ( % ) zuur in fermenteervaten. Diëten: N=entmateriaal; a-la(α-la)=α-lactalbumine; GMP=glycomacropeptide; BM = moedermelk. Donorleeftijd: 1 = 1 maand; 3 = 3 maanden; 6 = 6 maanden na de geboorte.

Er was echter een statistisch significant verschil (P<0.05) tussen de groepen voor de relatieve hoeveelheden van de belangrijkste zuren en n-butyraat. Acetaat en lactaat kwamen over het algemeen voor in een verhouding van 3:2, Met uitzondering van het entmateriaal van zuigelingen van 6 maanden oud, waar lactaat overheerste (P<0,01). de concentraties van n-butyraat Namen over het algemeen toe met de leeftijd van de donor, terwijl het Propionaat afnam totdat beide ongeveer gelijk waren in concentratie. Kleine hoeveelheden I-butyraat werden ook gevonden in alle donorleeftijd en in de moedermelk.

4 discussie

Op basis van eerdere studies wordt algemeen aangenomen dat zuigelingen die borstvoeding krijgen baat kunnen hebben bij microbiota die numeriek gedomineerd worden door bifidobacteriën en / of lactobacillen . van α-La en GMP werd eerder aangetoond dat ze in vitro geselecteerde zuivere culturen van bifidobacteriën significant stimuleren. Echter, vergelijkbare resultaten werden hier niet gezien in gemengde cultuur. In preliminaire batchculturen geïnoculeerd met volwassen fecaal materiaal, werd geen statistisch significant effect op de gunstige microflora waargenomen. Hetzelfde gold voor beide supplementen bij gebruik in continue kweek geïnoculeerd met fecaal materiaal van zuigelingen van verschillende leeftijdsgroepen. Ondanks dit, waren bifidobacteriën de dominante groep in zowel de testformules als de controle van de moedermelk, waar bifidobacteriën ook constant gedurende het experiment bleven. Een meer diepgaand effect werd gezien voor lactobacilli. Moedermelk verhoogde lactobacillen significant. Een geringe, maar statistisch niet significante stijging van het aantal lactobacillen werd aangetoond met GMP in de feces van zuigelingen van 3 maanden oud, een trend die zich voortzette in experimenten met fecaal materiaal van zuigelingen van 6 maanden oud.

beide formulasupplementen zouden ook een remmend effect hebben op een verscheidenheid aan pathogenen. Eerder is aangetoond dat GMP verschillende antipathogene eigenschappen heeft in zowel de koolhydraatketen die N-acetylneuraminezuur (siaalzuur) bevat als in het polypeptidegedeelte . De aanwezigheid van sialic zuren op het oppervlak van intestinale cellen wordt vaak vereist voor infectie van een verscheidenheid van enterische pathogenen en een exogene bron van GMP kan bacteriële adhesie remmen, die essentieel is voor infectie. Dit is aangetoond door Kawakami door het remmen van de hechting van enteropathogene E. coli aan menselijke intestinale cellijnen. Over het algemeen is de concentratie van siaalzuurhoudende bestanddelen hoger in moedermelk dan in zuigelingenvoeding. Een remmend effect van GMP op Bacteroides, clostridia en E. coli, drie potentieel pathogene organismen, werd waargenomen in deze studie. Terwijl in voorlopige batchculturen met volwassen fecale materiaaltellingen over het algemeen werden behouden, werd een neerwaartse trend waargenomen in continue kweek. Een statistisch significante reductie van deze organismen werd echter alleen waargenomen in culturen met fecaal materiaal bij zuigelingen van 6 maanden oud. Vergelijkbare resultaten werden waargenomen in moedermelk, die clostridia en E. coli significant verlaagde terwijl Bacteroides onveranderd bleven. In tegenstelling, basaal medium aanzienlijk verhoogde niveaus van Bacteroides waaruit blijkt dat veranderingen in de samenstelling van flora waren niet het gevolg van wash-out, maar afhankelijk van het fermentatiemedium.

α-La, een regulerend bestanddeel van lactosesynthase, heeft een hoge sequentieidentiteit met lysozymes van het c-type en heeft een vergelijkbare driedimensionale structuur die suggereert dat ze afkomstig zijn van een gemeenschappelijk voorouderlijk gen . Er zijn verschillende studies uitgevoerd om aan te nemen dat α-la vergelijkbare effecten op pathogenen zou kunnen hebben . In tegenstelling, Pelligrini et al. gevonden dat proteolytische spijsvertering door trypsine en pepsine drie peptiden met bactericide eigenschappen opleverde, meestal actief tegen gramnegatieve organismen. Bacteriostatische eigenschappen van gehydrolyseerd α-la werden specifiek waargenomen voor E. coli. In deze studie werd een remmend effect van α-la op Bacteroides, clostridia en E. coli waargenomen. Nogmaals, een statistisch significante vermindering van deze organismen werd alleen gevonden in culturen met fecaal materiaal bij zuigelingen van 6 maanden oud, een resultaat dat vergelijkbaar is met dat verkregen voor de controle op moedermelk.

onze studie bevestigde dat acetaat het belangrijkste SCFA was bij zuigelingen die borstvoeding kregen in vergelijking met zuigelingen die flesvoeding kregen, samen met lage concentraties propionaat en een bijna totale afwezigheid van butyraat in de eerste 117 levensdagen . Lactaat en acetaat kwamen over het algemeen voor in een verhouding van 2:3, wat de overheersende rol van bifidobacteriën in de microflora bevestigt, zoals beschreven door Rasic en Kurmann . Een hoge incidentie van lactaat is ook typerend voor onvolledige of snelle fermentatie vaak geassocieerd met een zure pH zoals gezien bij borstvoeding baby ‘ s . Dit werd hier echter niet bevestigd, aangezien het fecale entmateriaal van borstvoedende donoren die moedermelk vergisten een zuurprofiel opleverde dat vrijwel volledig van lactaat verstoken was. Aan de andere kant produceerden fecale monsters die α-la – en GMP-aangevuld formula vergisten een zuurprofiel dat kenmerkend is voor formula-fermentatie met hogere concentraties n-butyraat, die toenamen met de leeftijd van de donor . Acetaat bleef echter overheersend, zoals gezien bij uitsluitend zuigelingen die borstvoeding kregen.

samengevat hebben we de microbiologische effecten aangetoond van suppletie van zuigelingenvoeding met α-la en GMP. In vergelijking met eerdere in vitro studies waarbij zuivere culturen van bifidobacteriën werden gebruikt, werd geen bifidogeen effect van de twee supplementen waargenomen bij gebruik van fecale inocula. Er werd echter een statistisch significante vermindering van de potentieel pathogene microflora waargenomen die vergelijkbaar was met die waargenomen bij zuigelingen die borstvoeding kregen. In dit verband kan derhalve worden geconcludeerd dat α-la-en GMP-suppletie in combinatie met hoge hoeveelheden acetaat een gunstig effect hebben op de menselijke microflora.Dankbetuigingen de onderzoekers willen mevrouw Alethea Hill en de donoren en hun ouders bedanken voor hun steun, enthousiasme en onschatbare hulp voor het onderzoek.

Borriello
S. P.

(

1986

)

microbiële flora van het maagdarmkanaal

. In:

microbieel metabolisme in het spijsverteringskanaal

(

Hill
M. J.

, Ed.), pp.

2

16

.

CRC Press

,

Boca Raton, FL

.

Van Sonnenborn
U.

Stobernack
H.-P.

Proppert
Y

(

1990

)

De ontwikkeling van anaërobe darmflora bij pasgeborenen

.

voortgang. Med.
108

,

420

424

.

Mitsuoka
T.

(

1995

)

Comparative intestinal microbial ecology and metabolism in man and animals

. In:

Medische en Tandheelkundige Aspecten van Anaerobes

(

Duerden
B. I.

Wade
W. G.

Vuurkorf
J. S.

Eley
A.

Wren
B.

Hudson
M. J

, Eds.), pp.

87

107

.

Science Reviews

.

Harmsen
H. J. M.

Wildeboer-Veloo
A. C. M.

Raangs
G. C.

et al. (

2000

)

analyse van de ontwikkeling van de darmflora bij zuigelingen die borstvoeding krijgen en zuigelingen die borstvoeding krijgen met behulp van moleculaire identificatie-en detectiemethoden

.

J. Pediatr. Gastro-Enterol. Nutr.
30

,

61

67

.

Salminen
S.

Bouley
C.

Boutron-Ruault
M.-C.

et al. (

1998

)

functionele voedingswetenschap en gastro-intestinale fysiologie en functie

.

Br. J. Nutr.
80

,

S147

S171

.

Harmsen
H. J. M.

Gibson
G. R.

et al. (

1999

)

vergelijking van werkbare celtellingen en fluorescentie in situ hybridisatie met behulp van specifieke rRNA-gebaseerde sondes voor de kwantificering van menselijke fecale bacteriën

.

fems Microbiol. Lett.
183

,

125

129

.

Macfarlane
G. T.

Gibson
G. R.

Macfarlane
S.

(

1994

)

korte keten vetzuur-en lactaatproductie door menselijke darmbacteriën gekweekt in batch-en continue cultuur

. In:

korte-Ketenvetzuren

(

bindmiddel
H. J.

Cummings
J. H.

Soergel
K. H.

, Eds.), pp.

44

60

.

Kluwer Publishing

,

London

.

Allison
C.
McFarlan
C.
Macfarlane
G. T.

(

1989

)

studies op gemengde populaties van menselijke darmbacteriën gekweekt in enkelvoudige en meertraps continue kweeksystemen

.

Appl. CA. Microbiol.
55

,

679

683

.

Marsh
P.

(

1995

)

de rol van continue kweek bij het modelleren van de menselijke microflora

.

J. Chem. Technisch. Biotechnol.
64

,

1

9

.

Veilleux
B. G.

Rowland
I.

(

1981

)

continue kweeksysteem

.

J. Gen.Microbiol.
123

,

103

115

.

Macfarlane
G. T.

Macfarlane
S.

Gibson
G. R.

(

1998

)

de Validatie van een drie-traps samengestelde continue cultuur systeem voor onderzoek naar het effect van verblijftijd op de ecologie en het metabolisme van bacteriën in het menselijk colon

.

Microb. Ecol.
35

,

180

187

.

Edwards
C. A.

Parrett
A. M.

Balmer
S.E.

Wharton
B. A.

(

1994

)

Fecale korte keten vetzuren in de moedermelk gevoed en formule-gevoede baby ‘ s

.

Acta Paediatr.
83

,

459

462

.

Cummings
J. H.

(

1983

)

fermentatie in de menselijke dikke darm: bewijs en implicaties voor de gezondheid

.

Lancet
1

,

1206

1208

.

Midtvedt
T.

Carlstedt-Hertog
B.

Høverstad
T.

et al. (

1986

)

invloed van perorale antimicrobiële werking op de biotransformatoire activiteit van de darmmicroflora bij gezonde proefpersoon

.

Eur. J. Blink. Investeren.
16

,

11

17

.

Kawakami
H.

(

1997

)

Biological significance of sialic acid-containing substances in milk and their application

.

Recent Res. Dev. Agric. Biol. Chem.
1

,

193

207

.

Idota
T.

Kawakami
H.

Nakajima
I.

(

1994

)

Growth-promoting effects of N-actelylneuraminic acid containing substances on bifidobacteria

.

Biosci. Biotechnol. Biochem.
58

,

1720

1722

.

Bouhallab
S.

Favrot
C.

Maubois
J. L.

(

1993

)

Groei-het bevorderen van de activiteit van al verteren van caseinomacropeptide voor Lactococcus lactis ssp. lactis

.

melk
73

,

73

77

.

Xue
Y.

Lui
J. N.

Zon
Z

Mat
Z

Wu
C.

Zhu
D.

(

2001

)

α-Lactalbumine mutant handelen zoals lysozym

.

proteïnen Struct. Funct. Genet.
42

,

17

22

.

Pihlanto-Lappälä
A.

Marnila
P.

Hubert
L.

Rokka
T.

Korhonen
H. J. T.

carpaal
M.

(

1999

)

het effect van α-lactalbumine en β-lactalbumine hydrosylaten op de metabole activiteit van Escherichia coli JM103

.

J. Appl. Microbiol.
87

,

540

545

.

Petschow
B. W.

Talbott
D.

(

1991

)

respons van Bifidobacterium species op groeibevorderaars in menselijke en koemelk

.

Pediatr. Res.
29

,

208

213

.

Frank
A. H.

Harmsen
H. J. M.

Raangs
G. C.

et al. (

1998

)

variaties van bacteriële populaties in menselijke feces gemeten door fluorescerende in situ hybridisatie met groepspecifieke 16S rRNA-gerichte oligonucleotidesondes

.

Appl. CA. Microbiol.
64

,

3336

3345

.

Neeser
J. R.

Golliard
M.

Woltz
A.

Rouvet
M.

Dillmann
M. L.

Guggenheim
B.

(

1994

)

In-vitro-modulator van orale bacteriële hechting aan speeksel-gecoat hydroxypatite kralen door de melk derivaten van caseïne

.

orale Microbiol. Immunol.
9

,

193

201

.

Wold
A. E.

Adlerberth
I.

(

2000

)

gevolgen voor de bescherming van zuigelingen tegen infectieziekten

. In:

korte en lange termijn effecten van borstvoeding op de gezondheid van kinderen

(

Keletzo
B.

et al. , EDS.).

Kluwer Academic / Plenum Publishers

,

New York

.

Pelligrini
A.

Thomas
U.

Bramaz
N.

Hunziker
P.

von Fellenberg
R

(

1999

)

Isolatie en identificatie van de drie bactericide domeinen in de encefalopathie alpha-lactalbumine molecuul

.

Biochim. Biophys. Acta
1426

,

439

448

.

Siigur
U.

Ormission
A.

Tamm
A.

(

1993

)

fecale korte-ketenvetzuren bij zuigelingen met borstvoeding en flesvoeding

.

Acta Paediatr.
82

,

536

538

.

Wolin
M. J.

Yerry
S.

Miller
T. L.

Zhang
Y

Bank
S.

(

1998

)

veranderingen in de productie van ethanol, zuren en H2 uit glucose door de fecale flora van de 16 tot 158 dagen oude zuigeling

.

J. Nutr.
128

,

85

90

.

Rasic
J. L.
Kurmann
J. A.

(

1983

)

bifidobacteriën en hun rol

.

Birkhauser Verlag

,

Bazel

.

Tianan
J.

Savaiano
D. A.

(

1997

)

bewerken van colonfermentatie door bifidobacteriën en pH in vitro

.

Dig. Tien. Sci.
42

,

2370

2377

.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.