Bruk av batchkultur og et totrinns kontinuerlig kultursystem for å studere effekten av supplerende α-laktalbumin og glykomakropeptid på blandede populasjoner av humane tarmbakterier

Abstrakt

Visse melkefaktorer kan fremme veksten av en vertsvennlig gastrointestinal mikroflora. Dette kan forklare hvorfor ammende spedbarn opplever færre tarminfeksjoner enn deres formel-matet kolleger. Effekten av formeltilskudd med to slike faktorer ble undersøkt i denne studien. Avføringsprøver hos spedbarn ble brukt til å gjære formler supplert med glykomakropeptid og α-laktalbumin i en totrinns sammensatt kontinuerlig kulturmodell. Bakteriologi ble bestemt ved fluorescens in situ hybridisering. Beholdere som inneholdt brystmelk samt α-laktalbumin og glykomakropeptid hadde stabile tall for bifidobakterier, mens laktobaciller økte signifikant bare i beholdere med morsmelk. Bacteroides, clostridia og Escherichia coli redusert betydelig i alle løp. Acetat var den viktigste syren som ble funnet sammen med høye mengder propionat og laktat. Tilskudd av spedbarnsformler med passende melkeproteiner kan være nyttig for å simulere de gunstige bakteriologiske effektene av morsmelk.

1 Introduksjon

den menneskelige tykktarmen er et komplekst økosystem som har et stort utvalg av bakterier. Minst 400 forskjellige bakteriearter antas å være tilstede til enhver tid, med opptil 1012 bakterier funnet per g avføring . Mikrofloraen er ervervet ved fødselen, med den sterile nyfødte blir kolonisert av ulike bakterier under leveringsprosessen . I løpet av de første dagene av livet dominerer næringsfattige prokaryoter som enterobakterier, stafylokokker og streptokokker (inkludert enterokokker). Innen den første uka i livet blir slekter som bifidobakterier og Bakterier etablert . Det antas at ammende spedbarn har en kolonflora som numerisk domineres av bifidobakterier, mens de som er formel-matet, har mer komplekse mikrobiota som ligner i sammensetning til voksne . Bifidobakterier kan utøve kraftige antimikrobielle effekter mot en rekke intestinale patogener som visse Enterobacteriaceae og Clostridium spp. Som sådan er en overvekt av bifidobakterier sett på som en indikator på forbedret tarmhelse . Observasjoner på den normale tarmmikrofloraen er i stor grad avledet fra kvantitativ platekultur og fenotypisk karakterisering, som har begrensninger når det gjelder utvinningseffektivitet og operator subjektivitet .siden proksimal kolon er fysisk utilgjengelig for rutinemessige formål, har de fleste mikrobielle studier på fermentering blitt utført med fekale bakterier i enten batchkultur eller enkelttrinns kjemostater . Batchkultur tillater en bestemmelse av fermenterbarheten til forskjellige substrater i korte perioder (24 h). Det finnes imidlertid markerte forskjeller i substrattilgjengelighet og miljøforhold mellom proksimal og distal kolon, som ikke kan simuleres i et enkelt fartøyssystem .I motsetning til dette har in vitro-systemer som bruker flere gjæringsbeholdere justert i serie fordeler ved å kunne modellere mer komplekse miljøforhold samtidig som det muliggjør romlig og tidsmessig heterogenitet . For eksempel ble en to-trinns kjemostat med cellegjenvinning fra andre til første fase vist å gi tilfredsstillende resultater . Ytterligere foredling for modellering av voksen human kolon ble utført Av Macfarlane et al. ved hjelp av en tre-trinns sammensatt kontinuerlig kultur system. Dette ble mikrobiologisk validert mot humant kolonmateriale oppnådd fra plutselige dødsofre ved obduksjon. Slike modeller er verdifulle for å studere tarmmikrofloraen siden forskjellige fysisk-kjemiske forhold kan kontrolleres. Dette har klare økonomiske fordeler, men er spesielt relevant for planlegging av menneskelige studier.Forskjeller i fekal flora reflekteres også i varierende laktat -, kort-(SCFA) og forgrenede fettsyremønstre som er mellomliggende og sluttprodukter av bakteriell gjæring . Deres produksjonshastighet og fermenteringsmønster kan også bestemmes av substrattilgjengelighet for tarmbakterieflora . Derfor kan endringer i fekal flora fra en endring i kosthold, eller antimikrobiell terapi, også føre til endring i gjæringsmønstre og organisk syrekonsentrasjon . Mengden av slike syrer produsert hos mennesker er vanskelig å bestemme, og bare et lite antall studier har blitt utført som indikerer at hos voksne produseres mellom 300 mmol og 1-2 mol syre hver dag. Acetat ble funnet å være den viktigste SCFA produsert i alle tilfeller, og bevis tyder på at caecal SCFA konsentrasjoner er omtrent dobbelt så stor som i rekto-sigmoid området .

To melkekomponenter har tidligere vist seg å hemme gastrointestinale infeksjoner og / eller stimulere bifidobakterier in vitro. Glykomakropeptid (GMP), et derivat av κ-kasein, har blitt grundig studert in vitro og har vist seg å hemme adhesjonen av bakterier, virus og toksiner til cellemembranen gjennom binding til reseptorstedene til patogenet . Disse in vitro-analysene viste også AT GMP sterkt fremmet veksten Av Bifidobacterium breve, b. bifidum, b. infantis og Lactococcus lactis. α-Lactalbumin (α-la), som har en tertiær struktur som er sammenlignbar med c-type lysozymer, har vist seg å ha lignende effekter . Pihlanto-Lepp Hryvnja Et al. tidligere viste at α-la senket metabolsk aktivitet Av Escherichia coli JM103 til bare 21% av normal. I tillegg viste testingen av renset kumelk at α-la var en potent vekstfremmende for b. infantis og B. breve.

i denne studien brukte vi batchkultur og et totrinns sammensatt kontinuerlig kultursystem for å teste gjæringsegenskaper og bakterieaktiviteter etter tilskudd av spedbarnsformelfeeder med α-la og GMP. Det kontinuerlige kultursystemet ble tilpasset fra tretrinnsmodellen utviklet Av Macfarlane et al. . Dens mindre driftsvolum og raskere omsetningsrater forsøkte å ta hensyn til de fysiske faktorene som ble funnet hos menneskelige spedbarn. Vi testet om tilskudd av α – la og GMP kan endre gastrointestinalfloraen for å gi tilsvarende fordeler som observert hos ammende spedbarn.

2 Materialer og metoder

2.1 Batch kultur

for anaerobe batch kultur systemer, basal kultur medium inneholdt (per liter): 1 g peptone, 1 g gjær ekstrakt, 0.05 g NaCl, 0.02 g K2HPO4, 0.02 G KH2PO4, 0.005 g MgSO4·7H2O, 0.005 g CaCl2·6H2O, 1 g nahco3, 1 ml tween 80, 0.0025 g haemin, 5 µ vitamin K1, 0,25 g cystein HCl og 0,25 g gallesalter oppløst i 500 ml avionisert vann, justert til pH 7,0 og sterilisert ved autoklavering. Alle kjemikalier ble hentet Fra Sigma (Poole, Dorset, UK) med mindre annet er angitt. Sterilt medium (50 ml) ble plassert i 100 ml batchkulturflasker inneholdende 0,5 g (1% w/v) av en testformel (Arla Foods Ingredients, Viby, Danmark) supplert med enten α-la (68% w/v) eller GMP (80% w/v) og opprettholdt under en atmosfære av oksygenfri nitrogengass. Formlene ble sammenlignet med en standard som inneholdt 1% (w/w) laktose. Dagen etter ble en fersk fekal prøve samlet i en stomacherpose og behandlet umiddelbart. Forsøket ble gjentatt fem ganger ved hjelp av fem forskjellige givere.

batchkulturbeholderne ble inokulert med 5 ml av en 10% (w/v) fekal slurry fra friske voksne frivillige tilberedt med anaerob fosfatbufret saltvann (PBS, 0,1 M, pH 7,2) og 1 ml prøver ble tatt til tider 0 (før prøven ble plassert i batchkulturer), 6 timer og 24 timer og lagret ved 4°C til videre bruk. For telling av bakterier ved fluoriserende in situ hybridisering (FISH) ble 375-µ triplikater av innsamlet prøve fjernet og tilsatt til et 1,5 ml Eppendorf-rør inneholdende 1125 µ filtersterilisert 4% (w / v) paraformaldehyd I PBS (pH 7,2) og festet i minst 4 timer ved 4°C. den faste prøven ble deretter sentrifugert i 5 minutter ved 13 000×g og supernatanten kasserte. Pelleten ble resuspendert i 1 ml filtrert PBS (pH 7,4) inneholdende 0,00001% (w/v) cetyltrimetylammiumbromid og overført til Et eppendorf-rør for repelleting (13 000×g, 5 min). Etter vasking av pelleten en gang til ble supernatanten fjernet og pelleten resuspendert grundig i 150 µ av filtrert PBS og 150 µ av 96% (v/v) etanol. Prøven ble blandet godt og lagret ved -20°C i minst 1 h før hybridisering med en fluorescerende sonde (som beskrevet nedenfor).

2.2 to-trinns kontinuerlig kultursystem

det kontinuerlige kultursystemet besto av to glassbeholdere, V1 og V2, begge med et driftsvolum på 100 ml. Temperatur (37°C) og pH ble automatisk kontrollert. Kultur pH i fartøyene var 5.2 i V1, som representerer det lave ph-miljøet i proksimal kolon og 6,5 I V2, som indikerer en mer nøytral pH i distal kolon. Hver fermenter ble magnetisk omrørt og vekstmediet ble kontinuerlig sprutd med oksygenfritt nitrogen (15 ml min−1) og matet fra et glassmediumreservoar av en peristaltisk pumpe (Watson-Marlow, Falmouth, STORBRITANNIA) Til V1. V1 sekvensielt levert V2 via en overløp og en serie av demninger. Overløpet Fra V2 ble ført til en avfallsbeholder. Kulturmediet besto av (A) basalmediet beskrevet ovenfor med 1% (w/v) laktose tilsatt (Sigma, Poole, Dorset, STORBRITANNIA), (b) morsmelk hos mennesker (levert Av Royal Berkshire Hospital, Reading, STORBRITANNIA) med 0,5 g l−1l-cystein-HCl tilsatt, (C) testformel med 68% (w/v) supplerende α-la, 1% (w/v) laktose og 0,5 g l−1l-cystein-HCl, og (D) testformel med 68% (w/v) supplerende α−la, 1% (w/v) laktose og 0,5 g l-1l-cystein-HCl, og (D) testformel med 68% (w / v). w / v) gmp, 1% (w / v) laktose og 0,5 g l-1l-Cystein-Hcl. Alle formler ble hentet Fra Arla Foods Ingredienser (Viby, Danmark) og predigested ved bruk av pepsin (575 E per g protein) ved pH 2 for 2 h (37°C), etterfulgt av pankreatin (50 E per g protein) og 0,5 g l−1 volum gallesyre ved pH 6,5 for to h (37°C). For å sikre anaerobitet ble 4 ml l−1 av en 250 mg l−1 lageroppløsning av resazurin kokt og tilsatt til mediet. Mediene ble deretter oppvarmet til 80 hryvnias C i 20 min, avkjølt til romtemperatur over natten og oppvarmet til 80 hryvnias C i ytterligere 20 min før de kontinuerlig ble sparget Med O2-fri N2. Systemet ble operert ved en retensjonstid (R) på 12 h som beregnet som gjensidig fortynningshastighet. Systemretensjonstid utgjorde summen av individuelle r-verdier i hver fermenter. Hver fermenter ble inokulert med 15 ml av en fersk 10% (w/v) fekal slurry fra friske spedbarnsdonorer mellom 1 og 6 måneder og matet brystmelk med tilleggsformel. Slurryen ble fremstilt ved bruk av anaerob 0,1 M PBS (pH 7,2). Alle forsøkene ble gjentatt fem ganger ved hjelp av forskjellige donorer med unntak av gruppe B (morsmelk), hvor forsøket ble utført en gang ved bruk av fekal materiale fra en 3 måneder gammel, utelukkende ammet donor. Gruppe C og D hver inneholdt fem forskjellige individer. Prøver ble tatt etter 1, 3 og 6 måneders alder for å vurdere eventuelle forskjeller i fekal mikroflora og eventuelle endringer i effekt av kosttilskudd etter hvert som spedbarnene modnet. Fermenteringssystemet fikk lov til å balansere over natten før mediumpumpen ble startet, og ble kjørt i minst 144 timer for å etablere stabile forhold. 3 ml prøver av det opprinnelige inokulumet (N), etter likevekt (T0) og ved steady state-forhold (TS) ble tatt og forberedt FOR FISKEANALYSE som beskrevet ovenfor.

2,3 Bakteriell opptelling GJENNOM FISK

Oligonukleotidprober (Tabell 1) For Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp./ Enterococcus, Bacteroides spp. Clostridium histolyticum group og E. coli ble syntetisert og monomerket ved 5 ‘ – enden Med Cy3 (Ex 552 nm, Em 568 nm) av Enten Eurogentec (Abingdon, STORBRITANNIA) eller MWG-Biotech (Milton Keynes, STORBRITANNIA). Hybridiseringen ble utført over natten ved 50°C for Bifidobacterium og Clostridium, ved 45°C for Lactobacillus og Bacteroides og ved 37°C for E. coli. For hybridisering ble 200 µ filtrert buffer (40 Mm Tris–HCl pH 7,2, 1,8 M NaCl) inneholdende 20 ml l−1 av 10% (w/v) SDS og 64 µ AV hplc-grad vann tilsatt til 16 µ av faste celler og varmet opp til riktig temperatur. Forvarmet hybridiseringsløsning (90 µ) ble tilsatt til 10 µ fra den aktuelle sonden (endelig konsentrasjon 50 ng µ−1) og oppløsningen inkubert over natten i en hybridiserings ovn. For e. coli-sonden ble 264 hryvnias hybridiseringsbuffer inneholdende 35% (v/v) formamid tilsatt til 16 µ av faste celler. Cellene ble vasket ved tilsetning av 5 ml vaskebuffer (20 Mm Tris–HCl pH 7,2, 0,9 M NaCl) til 5-100 hryvnias hybridprøve, farget med 20 µ 4’,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, Ex 344, Em 450; 500 ng ml−1) og inkubert i en hybridiseringsovn i 30 min. For totalt antall ble 5-12 µ av prøven vakuumfiltrert på et 0,2-µ polykarbonatfilter i porestørrelse (Millipore, Watford, STORBRITANNIA) og plassert på et mikroskop-lysbilde. For å unngå falming av sondene ble en dråpe SlowFade-Light Antifade Kit component A (Molecular Prober Europe, Leiden, Nederland) tilsatt til filteret. Lysbilder ble undersøkt mikroskopisk ved HJELP AV ET epi-fluorescensfeste (Nikon UK, Kingston upon Thames, UK). UV-lys ble brukt til å telle dapi-farget bakterier og Cy3-farget celler ble nummerert ved 550 nm. Femten tilfeldige felt med god fordeling av celler (10-100) ble talt for hver sonde og prøve.

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

2.4 Volatile acid analysis

Undiluted aliquots (1.0 ml) av prøven ble dispensert i 1,5 ml Eppendorf-rør og sentrifugert (13 000×g, 5 min) til pelletsbakterier og andre faste stoffer. Supernatanten ble deretter filtrert ved bruk av et 0,2-µ polykarbonatfilter og tilsatt fire deler acetonitril inneholdende 4,3 mmol l−1 av 2-etylsmørsyre som intern standard. Kalibrering ble gjort ved hjelp av standardløsninger av eddiksyre, propionsyre, i-smørsyre, n-smørsyre, i-valerinsyre, n-valerinsyre, n-kapronsyre og dl-melkesyre i acetonitril. Fettsyrene ble bestemt ved gass-væskekromatografi på Et Gc-System I Agilent 6890-Serien (Agilent, Waldbronn, Tyskland) utstyrt med En Optima FFAP-kolonne (25 m×0,32 mm, Macherey-Nagel, Dü, Tyskland) og en flammejoniseringsdetektor. Bærergassen helium ble levert med en strømningshastighet på 1,8 ml min-1. Injektor, kolonne og detektor ble satt til henholdsvis 220°C, 140 Hryvnias C (isotermisk) og 220 hryvnias C. Etter 5 min ble kolonnetemperaturen økt til 240°C ved 20°C min – 1 trinn for å kjøre i ytterligere 15 min. Peaks ble integrert ved HJELP AV En PC som kjører Atlas Lab managing software (Thermo Lab Systems, Mainz, Tyskland). Fettsyrekonsentrasjoner ble beregnet ved å sammenligne toppområdene med de av den interne standarden og ble uttrykt som millimol per liter.

2,5 Statistisk analyse

Statistisk analyse ble utført ved bruk av enveis ANOVA (inokulum, versus steady-state, TS) for å bestemme signifikans Ved P<0,05 med mindre annet er angitt.

3 Resultater

3.1 Batch kultur

før inokulering inneholdt prøver nesten identisk Antall Bifidobacterium spp., Bacteroides spp. Og Clostridium spp. Laktobaciller var mindre tallrike. I kulturer som inneholder α-la (Fig. 1), totalt antall, bifidobakterier, clostridia, laktobaciller og Bakteroider forblir uendret. Antallet E. coli sank signifikant (P <0,01) med α-la-tilskudd etter 6 timers inkubasjon, men økte igjen til baseline-nivå (ikke vist).

1

Gjennomsnittlig bakterietall (log10) i voksen fekal inokulum og batchkulturer som inneholder basalt medium med 1% (w/w) laktose) eller 1% (w/w) testformel. Resultatene er midler (log10 per g våtvekt)±S. D. n=fekal inokulum; 24 timer, laktose=kultur etter 24 timer inkubasjon som inneholder laktose; 24 timer, a-la / GMP=kultur etter 24 timer inkubasjon som inneholder α-la eller GMP.

1

Gjennomsnittlig bakterietall (log10) i voksen fekal inokulum og batchkulturer som inneholder basalt medium med 1% (w/w) laktose) eller 1% (w/w) testformel. Resultatene er midler (log10 per g våtvekt)±S. D. n=fekal inokulum; 24 timer, laktose=kultur etter 24 timer inkubasjon som inneholder laktose; 24 timer, a-la / GMP=kultur etter 24 timer inkubasjon som inneholder α-la eller GMP.

Kulturer som inneholder GMP (Fig. 1) generelt opprettholdt antall bifidobakterier, Bacteroides, lactobacilli og clostridia. E. coli-teller ble betydelig redusert (P <0,05) etter 6 timer med inkubasjon, men igjen økt til basale nivåer (ikke vist).

3.2 to-trinns sammensatt kontinuerlig kultursystem

i beholdere som inneholder samme standardmedium (basalt medium som inneholder 1% w / w laktose, Fig. 2), totalt bakterietall, bifidobakterier, laktobaciller og clostridia forblir konstant. I motsetning til Dette økte Bakteroider betydelig i begge fermenteringskarene etter likevekt og holdt seg høyere enn inokulumnivåene ved steady state i begge karene(P < 0,05). En statistisk signifikant reduksjon (P<0,05) kunne observeres For E. coli i kar 2 (pH 6,5) etter likevekt. Dette ble imidlertid ikke opprettholdt, og begge fartøyene hadde sammenlignbare E. coli-nivåer ved steady state, som var lavere enn inokulumet.

2

Gjennomsnittlig bakterietall (log10) i fekal inokulum og kontrollfermenterbeholdere med basalt medium som inneholder 1% (w/w) laktose eller brystmelk (BM). Resultatene er midler (log10 per g våtvekt)±S. D. n=fekal inokulum; V1TS=beholder 1 ved steady state (pH 5,2); V2TS=beholder 2 ved steady state (pH 6,5).

2

Gjennomsnittlig bakterietall (log10) i fekal inokulum og kontrollfermenterbeholdere med basalt medium inneholdende 1% (w / w) laktose eller brystmelk (BM). Resultatene er midler (log10 per g våtvekt)±S. D. n=fekal inokulum; V1TS=beholder 1 ved steady state (pH 5,2); V2TS=beholder 2 ved steady state (pH 6,5).

etter karene som inneholder morsmelk (Fig. 2) ble overlatt til likevekt i 24 timer, en statistisk signifikant økning (P<0,05) ble observert for laktobaciller i kar 2 (pH 6.5), som ble beholdt til steady state ble nådd. Antallet Bifidobacterium forblir stabilt. I kontrast reduserte clostridia (P<0,01) signifikant i begge fartøy og forsvant helt fra fartøy 1 (pH 5,2) ved steady state. Tilsvarende reduksjoner (P < 0,05) ble observert For E. coli i kar 1 (pH 5,2), men ikke i kar 2 (pH 6,5). Fartøy som inneholdt α-la og inokulert med fekal prøver fra 1 – og 3 måneder gamle spedbarn hadde stabile totaltall samt nivåer av andre bakterier (ikke vist). Når fermentorene ble inokulert med avføringsprøver oppnådd fra 6 måneder gamle spedbarn (Fig. 3), totalt antall og lactobacilli teller forble uendret. Antallet bakterier, clostridier og E. coli ble merkbart redusert etter likevekt, og en statistisk signifikant reduksjon (P<0,05) ble observert ved begge pH-nivåene. Fartøy som inneholdt GMP og inokulert med avføringsprøver fra 1-og 3 måneder gamle spedbarn hadde totalt antall Bakterier Og E. coli som svingte, men holdt seg stabile. Som observert med α-la viste laktobasiller en svak oppadgående trend sammenlignet med de opprinnelige prøvene, men statistisk signifikans ble ikke observert (ikke vist). Når fermentorene ble inokulert med avføring fra 6 måneder gamle spedbarn (Fig. 3), totalt antall, laktobaciller og bifidobakterier forblir uendret. Antall bakterier, clostridium og E. coli ble merkbart redusert etter likevekt, og en statistisk signifikant reduksjon (P<0,05), lik den som ble sett med α-la-supplert formel, ble observert ved begge pH-nivåer.

3

Gjennomsnittlig bakterietall i inokulum-og fermenterbeholdere (log10) som inneholder α-la eller GMP ved bruk av avføring fra 6 måneder gamle donorer. Resultatene er midler (log10 per g våtvekt)±S. D. n=fekal inokulum; V1TS=beholder 1 ved steady state (pH 5,2); V2TS=beholder 2 ved steady state (pH 6,5).

3

Gjennomsnittlig bakterietall i inokulum-og fermenterbeholdere (log10) som inneholder α – la eller GMP ved bruk av avføring fra 6 måneder gamle donorer. Resultatene er midler (log10 per g våtvekt)±S. D. n=fekal inokulum; V1TS=beholder 1 ved steady state (pH 5,2); V2TS=fartøy 2 ved steady state (pH 6,5).

3,3 Organiske syrer

Totale mengder organiske syrer varierte signifikant statistisk (P<0,05) mellom inokulaen og prøvetidene med gjennomsnittlig total syre for inokulaen er 4,28 mmol l−1, 8,16 mmol l−1 og 15,64 mmol l−1 sammenlignet med 73,80 mmol/l−1 (område 18,93–160,49), 39,29 mmol l−1 (område 15,30–100,28) og 80,49 mmol l−1 (område 28,07–177,34) for henholdsvis 1-, 3 – og 6 måneder gamle donorer. Standard feil var 4.96%, 3.10%, 2.61%, 1.80%, 0.91%, 0.84%, 1.91% og 5.12% for henholdsvis acetat, propionat, i-butyrat, n-butyrat, i-valerat, n-valerat, kaproat og laktat. Acetat var den dominerende syren i alle grupper (Fig. 4) etterfulgt av laktat og propionat, gjennomsnittlig 63%, 21%, 11% av total syre henholdsvis. d (-) – Laktat ble hovedsakelig funnet sammenlignet med l (+) – laktat som kun forekom sporadisk og i minimale mengder. Ingen statistisk signifikante forskjeller ble funnet mellom studiegrupper for isosyrer, valerat og kaproat, som forekom i spormengder.

4

Gjennomsnittlig relative mengder ( % ) av syre i fermenterbeholdere. Dietter: N=inokulum; a-la (α-la)=α-laktalbumin; GMP=glykomakropeptid; BM=morsmelk. Donoralder: 1 = 1 måned; 3=3 måneder; 6=6 måneder etter fødselen.

4

Gjennomsnittlig relative mengder (%) av syre i fermenterbeholdere. Dietter: N=inokulum; a-la (α-la)=α-laktalbumin; GMP=glykomakropeptid; BM=morsmelk. Donoralder: 1 = 1 måned; 3=3 måneder; 6=6 måneder etter fødselen.

det var imidlertid en statistisk signifikant forskjell (P<0.05) mellom gruppene for de relative mengder av de store syrer og n-butyrat. Acetat og laktat forekom vanligvis i et forhold på 3: 2 med unntak av inokulumet til 6 måneder gamle spedbarn, hvor laktat dominerte (P<0,01). n-Butyratkonsentrasjoner økte generelt med donoralder mens propionat ble redusert til begge var omtrent like i konsentrasjon. Små mengder i-butyrat ble også funnet i alle donoraldersgrupper så vel som i brystmelkgruppen.

4 Diskusjon

Basert på tidligere studier er det generelt antatt at ammende spedbarn kan ha nytte av mikrobiota som numerisk domineres av bifidobakterier og / eller laktobasiller . α-La og GMP ble tidligere funnet å stimulere signifikant utvalgte rene kulturer av bifidobakterier in vitro. Imidlertid ble lignende resultater ikke sett her i blandet kultur. I foreløpige batchkulturer inokulert med voksent fekalt materiale ble det ikke observert noen statistisk signifikant effekt på den gunstige mikrofloraen. Det samme gjaldt for begge kosttilskuddene når de ble brukt i kontinuerlig kultur inokulert med fekal materiale fra spedbarn i ulike aldersgrupper. Til tross for dette var bifidobakterier den dominerende gruppen i både testformlene og brystmelkkontrollen, hvor bifidobakterier også holdt seg konstant gjennom forsøket. En mer dyp effekt ble sett for laktobaciller. Brystmælk økte signifikant laktobaciller. En mindre, men statistisk ubetydelig økning av laktobacilli teller ble vist MED GMP i feces av 3 måneder gamle spedbarn, en trend som fortsatte i eksperimenter med fecal materiale av 6 måneder gamle spedbarn.

Begge formel kosttilskudd er også antatt å ha noen hemmende effekt på en rekke patogener. GMP ble tidligere vist å ha flere anti-patogene egenskaper i både karbohydratkjeden som inneholder N-acetylneuraminsyre (sialinsyre) så vel som i polypeptiddelen . Tilstedeværelsen av sialinsyrer på overflaten av tarmceller er ofte nødvendig for infeksjon av en rekke enteriske patogener, og en eksogen KILDE TIL GMP kan hemme bakteriell adhesjon, noe som er viktig for infeksjon. Dette har Blitt demonstrert Av Kawakami ved å hemme adhesjonen av enteropatogen E. coli til humane tarmcellelinjer. Generelt er konsentrasjonen av sialinsyreholdige komponenter høyere i morsmelk enn i morsmelkerstatning. En hemmende effekt AV GMP på Bacteroides, clostridia Og E. coli, tre potensielt patogene organismer, ble observert i denne studien. Mens i foreløpige batch kulturer ved hjelp av voksen fekal materiale teller ble generelt bevart, en nedadgående trend ble sett i kontinuerlig kultur. En statistisk signifikant reduksjon av disse organismene ble imidlertid bare påvist i kulturer som kjørte fecal materiale av 6 måneder gamle spedbarn. Lignende resultater ble observert i morsmelk, noe som signifikant reduserte clostridia og E. coli mens Bakteroider forblir uendret. I motsetning til dette økte basalmediet signifikant Nivåer Av Bakteroider som viste at endringer i sammensetningen av flora ikke var et resultat av utvasking, men avhengig av gjæringsmediet.

α-La, en regulatorisk komponent av laktosesyntase, deler et høyt nivå av sekvensidentitet til c-type lysozymer og har en lignende tredimensjonal struktur som tyder på at de kom fra et felles forfedre gen . Flere studier har blitt utført for å antyde at α-la kan ha lignende effekter på patogener . I kontrast, Pelligrini et al. funnet at proteolytisk fordøyelse av trypsin og pepsin ga tre peptider med bakteriedrepende egenskaper, mest aktive mot Gram-negative organismer. Bakteriostatiske egenskaper ved hydrolysert α-la ble sett spesielt for E. coli. En hemmende effekt av α-la på Bakteroider, clostridia og E. coli ble observert i denne studien. Igjen ble en statistisk signifikant reduksjon av disse organismene bare påvist i kulturer som kjørte fecal materiale av 6 måneder gamle spedbarn, et resultat som var sammenlignbart med det som ble oppnådd for brystmelkkontroller.Studien vår bekreftet at acetat var DEN viktigste SCFA hos spedbarn som ammes sammenlignet med spedbarn som fikk flaske, sammen med lave konsentrasjoner av propionat og et nesten totalt fravær av butyrat i de første 117 dagene av livet . Laktat og acetat forekom vanligvis i et 2: 3-forhold, noe som bekrefter bifidobakteriens dominerende rolle i mikrofloraen som beskrevet Av Rasic og Kurmann . En høy forekomst av laktat er også typisk for ufullstendig eller rask gjæring som ofte er forbundet med en sur pH som sett hos ammende babyer . Dette ble imidlertid ikke bekreftet her siden fekal inokulum av ammende givere som fermenterte brystmelk, ga en syreprofil nesten helt uten laktat. På den annen side ga fekal-prøver som fermenterte α – la-og GMP-supplert formel en syreprofilkarakteristikk ved formelfermentering med høyere konsentrasjoner av n-butyrat, som økte med donoralderen . Acetat forblir imidlertid fortsatt dominerende som sett hos utelukkende ammende spedbarn.

oppsummert har vi vist de mikrobiologiske effektene av tilskudd av morsmelkerstatning med α-la og GMP. Sammenlignet med tidligere in vitro-studier med rene kulturer av bifidobakterier, ble det ikke observert en bifidogen effekt av de to kosttilskuddene ved bruk av fekal inokula. Det ble imidlertid observert en statistisk signifikant reduksjon av den potensielt patogene mikrofloraen som var lik den som ble observert hos ammende spedbarn. I denne sammenheng kan det derfor konkluderes med at α-la og GMP-tilskudd i kombinasjon med høye mengder acetat har gunstige effekter på den humane mikrofloraen.

Takk

forskerne vil gjerne takke Fru Alethea Hill, samt giverne og deres foreldre for deres støtte, entusiasme og uvurderlig hjelp til studien.

Borriello
S. P.

(

1986

)

Mikrobiell flora av mage-tarmkanalen

. I:

Mikrobiell Metabolisme i Fordøyelseskanalen

(

Hill
Mj

, Ed.), pp.

2

16

.

CRC Trykk

,

Boca Raton, FL

.

y. (

1990

)

utviklingen av anaerob tarmflora hos nyfødte

.

Fremgang. Med.
108

,

420

424

.

Mitsuoka

T.

(

1995

)

Komparativ intestinal mikrobiell økologi og metabolisme hos mennesker og dyr

. I:

Medisinsk og Dental Aspekter av Anaerober

(

Duerden
B. I.

Vasse
W. G.

Brazier
J. S.

Eley
A.

Wren
B

Hudson
M. J

, Red.), pp.

87

107

.

Vitenskap Anmeldelser

. div > g. c. et al. (

2000

)

Analyse av tarmflorautvikling hos ammende og formelmatte spedbarn ved hjelp av molekylære identifikasjons-og deteksjonsmetoder

.

J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr.
30

,

61

67

. c. et al. (

1998

)

Funksjonell matvitenskap og gastrointestinal fysiologi og funksjon

.

Br. J. Nutr.
80

,

S147

S171

. Et al. (

1999

)

Sammenligning av brukbare celletall og fluorescens in situ hybridisering ved hjelp av spesifikke rrna-baserte prober for kvantifisering av humane fekale bakterier

.

FEMS Mikrobiol. Lett.
183

,

125

129

.

G. T.

Gibson
Macfarlane

S.

(

1994

)

Kort kjede fettsyre og laktat produksjon av humane tarmbakterier dyrket i batch og kontinuerlig kultur

. I:

Kortkjedede Fettsyrer

(

Bindemiddel

, Eds.), pp.

44– / div> –

60

.

Kluwer Publishing

,

London

.

G. T. (

1989

)

studier på blandede populasjoner av humane tarmbakterier dyrket i enkelt-og flertrinns kontinuerlige Kultursystemer

.

Appl. Ca. Mikrobiol.
55

,

679

683

. P. (

1995

)

rollen som kontinuerlig kultur i modellering av den menneskelige mikroflora

.

J. Chem. Høyteknologisk. Bioteknologi.
64

,

1

9

.

I. (

1981

)

Simulering av rotte tarm økosystem ved hjelp av et to-trinns kontinuerlig kultursystem

.

J. Gen. Mikrobiol.
123

,

103– / div> –

115

.

G. r.

(

1998

)

validering av et tretrinns sammensatt kontinuerlig kultursystem For undersøkelse Av Effekten Av Retensjonstid På økologi Og metabolisme av bakterier I Humant Kolon

. Mikrob . Ecol.

35

,

180

187

.

Edwards
C. A.

B. a. (

1994

) div>fekale kortkjedede fettsyrer I ammende og formelmatte babyer. Acta Paediatr .

83

,

459

462

.

Cummings

Jh

(

1983

)

Gjæring i tykktarmen hos mennesker: Bevis og konsekvenser for helse

. 1,

1206

1208

. t. et al. (

1986

)

Påvirkning av peroral antimikrobiell på biotransformatorisk aktivitet av tarmmikrofloraen hos sunt emne

. Eur . J. Blink. Investere.

16

,

11

17

. H. (

1997

)

Biological significance of sialic acid-containing substances in milk and their application

.

Recent Res. Dev. Agric. Biol. Chem.
1

,

193

207

.

Idota
T.

Kawakami
H.

Nakajima
I.

(

1994

)

Growth-promoting effects of N-actelylneuraminic acid containing substances on bifidobacteria

.

Biosci. Biotechnol. Biochem.
58

,

1720

1722

.

J. L.

(

1993

)

vekstfremmende aktivitet av tryptisk fordøyelse av kaseinomakropeptid For Lactococcus Lactis ssp. lactis

.

Melk
73

,

73

77

.

J. N.

(

2001

)

α-laktalbumin Mutant som fungerer som lysozym

.

Proteiner Struct. Funct. Genet.
42

,

17

22

.

l.
rokka
t.

Korhonen
Carpal
M.

(

1999

)

effekten av α-laktalbumin og β-laktalbumin på Den metabolske aktiviteten Til Escherichia coli jm103

.

J. Appl. Mikrobiol.
87

,

540

545

.

Petschow

(

1991

)

Respons Av bifidobacterium arter til vekst arrangører i human og kumelk

.

Barn. Res.
29

,

208

213

. G. c. et al. (

1998

)

Variasjoner av bakteriepopulasjoner i menneskelig avføring målt ved fluorescerende in situ hybridisering med gruppespesifikke 16s rRNA-målrettede oligonukleotidprober

.

Appl. Ca. Mikrobiol.
64

,

3336

3345

. A. div> (

1994

)

in vitro modulator av oral bakteriell adhesjon til spyttbelagte hydroksypatittperler av melkekaseinderivater

.

Oral Mikrobiol. Immunol.
9

,

193

201

.

Wold

I. (

2000

)

Amming og amming.intestinal mikroflora av spedbarnet-implikasjoner for beskyttelse mot smittsomme sykdommer

. I: Korte Og Langsiktige Effekter Av Amming på Barns Helse (

Keletzo
B.

et al. Eds.).

Kluwer Academic / Plenum Publishers

,

New York

. A. r. (

1999

)

isolering og identifisering av tre bakteriedrepende domener i encefalopati alfa-laktalbuminmolekylet

.

Biochim. Biophys. Acta
1426

,

439

448

. (

1993

)

Fekale kortkjedede fettsyrer i bryst-og flaskefedte spedbarn

. Acta Paediatr .

82

,

536

538

. >

zhang
y.

Bank
S.

(

1998

)

Endringer i produksjon av etanol, syrer og H2 fra glukose ved fekal flora av det 16 – til 158-dag gamle ammende spedbarnet

. J. Nutr .

128

,

85

90

.

Rasic

Kurmann (

1983

)

Bifidobakterier og Deres rolle

.

Birkhauser Verlag

,

Basel

.

J.

Savaiano
Da

(

1997

)

Redigering av kolonfermentering av bifidobakterier og pH in vitro

. Dig. Ti. Sci.

42

,

2370

2377

.

Legg igjen en kommentar

Din e-postadresse vil ikke bli publisert.