ヒト腸内細菌の混合集団に対するα-ラクトアルブミンおよびグリコマクロペプチドの効果を研究するためのバッチ培養および二段階連続培養システムの使用

要約

特定の乳因子は、宿主に優しい胃腸微生物叢の成長を促進することができる。 これは母乳で育てられた幼児が彼らの方式与えられた同等より少数の腸の伝染をなぜ経験するか説明するかもしれません。 この研究では、このような二つの因子による処方補充の効果を調べた。 乳児糞便試料を用いて,グリコマクロペプチドとα-ラクトアルブミンを添加した製剤を二段階化合物連続培養モデルで発酵させた。 細菌学は蛍光in situハイブリダイゼーションによって決定された。 母乳,α-ラクトアルブミン,グリコマクロペプチドを含む血管はビフィズス菌の数が安定していたが,乳酸菌は母乳を含む血管でのみ有意に増加した。 Bacteroides,clostridiaおよびEscherichia coliは全ランで有意に減少した。 アセテートはプロピオン酸塩および乳酸塩の多量と共に見つけられる主な酸でした。 適切なミルク蛋白質が付いている幼児方式の補足は母乳の有利な細菌学の効果の模倣に有用かもしれません。

1はじめに

人間の大腸は、細菌の広大な範囲を保有する複雑な生態系です。

1はじめに

人間の大腸は、 少なくとも400種類の細菌種が一度に存在すると考えられており、糞便1gあたり最大1012個の細菌が発見されている。 微生物叢は出生時に獲得され、滅菌新生児は送達プロセス中に様々な細菌によって植民地化される。 人生の最初の数日間、腸内細菌、ブドウ球菌および連鎖球菌(腸球菌を含む)のような栄養的に多くを求めない原核生物が優勢である。 生命の最初の週以内に、bifidobacteriaおよびBacteroidesのような属は確立されるようになります。 母乳を与えられた幼児はビフィズス菌によって支配される結腸細菌叢を持っていると考えられているが、母乳を与えられた人は成人のものと組成が類似しているより複雑な微生物叢を持っていると考えられている。 Bifidobacteriaはある特定のEnterobacteriaceaeおよびClostridium sppのようないろいろな腸の病原体に対して強力な抗菌効果を出すことができます。 このように、ビフィズス菌の優位性は、腸の健康改善の指標の1つとして見られています。 正常な腸内微生物叢の観察は、主に回収効率と操作者の主観性の面で制限がある定量的なプレート培養と表現型の特性評価に由来しています。

さらに、近位結腸は日常的な目的のために物理的にアクセスできないため、発酵に関する微生物研究の大部分は、バッチ培養または単一段階のケモ バッチ培養は、短い期間(24h)の間に様々な基板の発酵性の決定を可能にする。 しかし、顕著な違いは、単一の血管系でシミュレートすることはできません近位および遠位結腸の間の基板の可用性と環境条件に存在します。対照的に、複数の発酵容器を直列に整列させたin vitroシステムは、空間的および時間的な不均一性を可能にしながら、より複雑な環境条件をモデル化 例えば、第二段階から第一段階への細胞リサイクルを伴う二段階のケモスタットは、満足のいく結果を生成することが示された。 成体ヒト結腸をモデル化するためのさらなる改良は、Macfarlane e t a l. 三段階の化合物連続培養システムを使用する。 これは、剖検での突然死の犠牲者から得られたヒト結腸材料に対して微生物学的に検証された。 このようなモデルは、異なる物理化学的条件を制御することができるので、腸内微生物叢を研究するために貴重である。 これには明らかな経済的利点がありますが、特に人間研究の計画に関連しています。糞便細菌叢の違いは、細菌発酵の中間生成物および最終生成物である乳酸、短(SCFA)および分岐鎖脂肪酸パターンの変化にも反映される。

糞便細菌叢の違いは、細菌発酵の中間生成物および最終生成物である。 それらの生産速度および発酵パターンは、腸内細菌叢に対する基質の利用可能性によっても決定され得る。 したがって、食事の変化、または抗菌療法からの糞便細菌叢の変化は、発酵パターンおよび有機酸濃度の変化をもたらす可能性もある。 ヒト被験者で産生されるそのような酸の量は決定することが困難であり、成人では毎日300mmolと1-2molの酸が産生されることを示す少数の研究のみが 酢酸はすべての症例で産生される主要なSCFAであることが判明し,盲腸SCFA濃度は直腸-s状結腸領域の濃度の約二倍であることを示唆している。

二つのミルク成分は、以前に胃腸感染を阻害し、および/またはin vitroでビフィズス菌を刺激することが示されています。 Γ-カゼインの誘導体であるグリコマクロペプチド(GMP)はinvitroで広く研究されており,病原体の受容体部位への結合により細菌,ウイルスおよび毒素の細胞膜への接着を阻害することが示された。 これらのinvitroアッセイはまた,GMPがbifidobacteriumbreve,B.bifidum,B.infantisおよびLactococcuslactisの成長を強く促進することを示した。 c型リゾチームに匹敵する三次構造を有するα-ラクトアルブミン(α-la)は、同様の効果を有することが示されている。 Pihlanto-Leppälä et al. 以前は、α-laが大腸菌JM103の代謝活性を正常のわずか21%に低下させることを示した。 さらに、精製された牛のミルクのテストはα-laがB.infantisおよびB.breveのための有効な成長促進者であることを示しました。

本研究では、バッチ培養および二段階化合物連続培養システムを使用して、α-laおよびGMPを添加した乳児用調製粉乳飼料の補給後の発酵特性およ 連続培養系は,Macfarlaneらによって開発された三段階モデルから適応した。 . そのより小さい操作容積およびより速い回転率は人間の幼児で見つけられる物理的な要因を説明するように試みた。 我々は、α-laおよびGMPの補給が胃腸細菌叢を変化させて、授乳中の乳児で観察されたものと同様の利益をもたらすかどうかを試験した。1Gのペプトン、1gの酵母抽出物、0.05gのNaCl、0.02gのK2HPO4、0.02gのKH2PO4、0.005gのMgso4・7H2O、0.005gのCacl2・6H2O、0.005gのNaCl、0.005gのNaCl、0.005gのNaCl、0.005gのNaCl、1g nahco3,1mlトゥイーン80,0.0025g haemin、5μ lのビタミンK1、0.25gのシステインHClおよび0.25gの胆汁塩を500mlの脱イオン水に溶解し、pH7.0に調整し、オートクレーブにより滅菌する。 特に記載のない限り、全ての化学物質は、Sigma(Poole,Dorset,UK)から入手した。 5g(1%w/v)のα−la(6 8%w/v)またはGMP(8 0%w/v)のいずれかを添加した試験式(Arla Food Ingredients,Viby,Denmark)を含有する1 0 0mlバッチ培養ボトルに滅菌培地(5 0m l)を入れ、無酸素窒素ガ この式を、1%(w/w)ラクトースを含有する標準と比較した。 翌日、新鮮な糞便サンプルをstomacher袋に集め、すぐに処理しました。 実験は五つの異なるドナーを用いて五回繰り返された。

バッチ培養容器に、嫌気性リン酸緩衝生理食塩水(PBS、0.1M、pH7.2)で調製した健康な成人ボランティアからの5mlの10%(w/v)糞便スラリーを接種し、1-mlの試料を0回(バッチ培養に試料を置く前)、6時間および24時間で採取し、さらなる使用まで4℃で保存した。 蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)による細菌の計数のために、収集された試料の375μ l三重物を除去し、PBS(pH7.2)中の1125μ lのフィルター滅菌された4%(w/v)パラホルムアルデヒドを含む1.5ml Eppendorf管に加え、4℃で少なくとも4時間固定した。 0 0 0 0 1%(w/v)臭化セチルトリメチルアンモニウムを含有する1mlの濾過PBS(pH7. ペレットを2回洗浄した後、上清を除去し、濾過したPBS1 5 0μ lおよび9 6%(v/v)エタノール1 5 0μ l中にペレットを十分に再懸濁した。 試料を十分に混合し、蛍光プローブとのハイブリダイゼーションの前に少なくとも1時間−2 0℃で保存した(以下に記載するように)。

2.2二段連続培養システム

連続培養システムは、二つのガラス容器、V1とV2、両方の動作容量100mlで構成されていました。 温度(37°C)およびpHは自動的に制御されました。 血管内の培養pHは5であった。は、近位結腸の低pH環境を表し、V2は、遠位結腸におけるより中性のpHを示す。 各発酵槽を磁気的に撹拌し、成長培地に無酸素窒素(1 5m l min−1)を連続的に散布し、蠕動ポンプ(Watson−Marlow,Falmoush,UK)によってガラス培地貯蔵所からV1に供給した。 V1は、オーバーフローと一連の堰を介してv2を順次供給しました。 V2からの流出は廃棄物容器に導かれた。 培地は、(A)1%(w/v)ラクトースを添加した上記の基礎培地(Sigma,Poole,Dorset,UK)、(B)0.5gのl−1l−システイン−Hclを添加したヒト母乳(Royal Berkshire H Hospitalpital,Reading,UKから提供)、(C)6 8%(w/v)補足α−la、1%(w/v)ラクトースおよび0.5gのl−1l-システイン-Hcl。 すべての処方は、Arla Foods成分(Viby、デンマーク)から得られ、ペプシン(575u/gタンパク質)を使用して2時間(37℃)のpH2で、続いてパンクレアチン(50u/gタンパク質)および0.5g l−1体積胆汁酸をph6.5で2時間(37℃)で予め消化された。 嫌気性を確実にするために、4mlのl−1の2 5 0mgのl−1貯蔵液のレサズリンを煮沸し、培地に添加した。 次いで、培地を8 0℃に2 0分間加熱し、一晩室温に冷却し、さらに2 0分間8 0℃に加熱してから、O2を含まないN2で連続的に散布した。 このシステムは、希釈率の逆数として計算された1 2時間の保持時間(R)で作動させた。 システム保持時間は、各発酵槽における個々のR値の合計を構成した。 各発酵槽に、15mlの新鮮な10%(w/v)糞便スラリーを1-6ヶ月齢の健康な乳児ドナーから接種し、補足式で母乳を与えた。 スラリーを嫌気性0.1M PBS(pH7.2)を用いて調製した。 すべての実験は、実験が3ヶ月齢、排他的に母乳ドナーの糞便材料を使用して一度行われたグループB(母乳)を除いて、異なるドナーを使用して五回繰り返され グループCとDはそれぞれ五つの異なる個体を含んでいた。 サンプルは、糞便微生物叢の違いおよび乳児が成熟するにつれてサプリメントの有効性の変化を評価するために、生後1、3、および6ヶ月後に採取した。 培地ポンプを開始する前に、発酵システムを一晩平衡化させ、定常状態条件を確立するために少なくとも1 4 4時間実行した。 元の接種物(N)の3mlサンプルを、平衡化後(T0)、および定常状態条件(T s)で採取し、上記のようにFIS h分析のために調製した。

2.3FISHを介した細菌の列挙

Bifidobacterium sppのオリゴヌクレオチドプローブ(表1)。、ラクトバチルス属。/Enterococcus,Bacteroides spp. 、Clostridium histolyticum群およびE. 大腸菌を合成し、Eurogentec(Abingdon,UK)またはMWG−Biotech(Milton Keynes,UK)のいずれかによってCy3(Ex5 5 2nm、Em5 6 8nm)で5’末端に単標識した。 ハイブリダイゼーションは、BifidobacteriumおよびClostridiumの場合は50℃、LactobacillusおよびBacteroidesの場合は45℃、E.coliの場合は37℃で一晩行った。 ハイブリダイゼーションのために、20ml l–1の10%(w/v)SDSおよび64μ LのHPLCグレードの水を含む200μ Lの濾過緩衝液(40mM Tris−HCl pH7.2、1.8M NaCl)を16μ lの固定細胞に添加し、適切な温度に加温した。 予め温めたハイブリダイゼーション溶液(9 0μ l)を1 0μ lの適切なプローブ(最終濃度5 0ng μ l−1)に加え、この溶液をハイブリダイゼーションオーブン中で一晩インキュベートした。 大腸菌プローブの場合、3 5%(v/v)のホルムアミドを含有する2 6 4μ lのハイブリダイゼーション緩衝液を1 6μ lの固定細胞に添加した。 細胞を、5ml洗浄緩衝液(20mM Tris–HCl pH7.2、0.9M NaCl)を5〜100μ lのハイブリダイゼーション試料に加えて洗浄し、20μ lの4’、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、Ex344、Em450、500ng ml−1)で染色し、ハイブリダイゼーションオーブン中で30分間インキュベートした。 2μ mの孔サイズのポリカーボネートフィルター(Millipore,Watford,UK)上に真空濾過し、顕微鏡スライド上に置いた。 プローブの退色を避けるために、1滴のSlowfade−Light Antifade Kit成分A(Molecular Probes Europe,Leiden,The Netherlands)をフィルタに加えた。 スライドを、EPI−蛍光アタッチメント(Nikon UK、Kingston apon Thames、UK)を使用して顕微鏡的に調べた。 DAPI染色細菌を計数するためにUV光を使用し、Cy3染色細胞を5 5 0nmで列挙した。 細胞(10-100)の良好な分布を有する十五ランダムフィールドは、各プローブとサンプルのためにカウントされました。

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
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Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

2.4 Volatile acid analysis

Undiluted aliquots (1.5mlのEppendorf管に分注し、遠心分離(1 3 0 0 0×g、5分間)して細菌および他の固形物をペレット化した。 次いで、上清を0.2μ mポリカーボネートフィルターを用いて濾過し、内部標準として4.3mmol l-1の2−エチル酪酸を含有するアセトニトリル四部に添加した。 アセトニトリル中の酢酸,プロピオン酸,i-酪酸,n-酪酸,i-吉草酸,n-吉草酸,n-カプロン酸,dl-乳酸の標準溶液を用いて校正を行った。 3 2mm,Macherey−Nagel,Duren,Germany)および火炎イオン化検出器を装着したAgilent6 8 9 0シリーズGCシステム(Agilent,Waldbronn,Germany)上で気液クロマトグラフィーにより脂肪酸を測定した。 キャリアガスヘリウムは1.8ml min−1の流量で送達された。 インジェクタ、カラム、および検出器は、それぞれ220℃、140℃(等温)、および220℃に設定した。 5分後、カラム温度を2 0℃分−1増分で2 4 0℃に上昇させ、さらに1 5分間実行した。 ピークを、Atlas Lab管理ソフトウェア(Thermo Lab Systems,Mainz,Germany)を実行するPCを使用して統合した。 脂肪酸濃度は、それらのピーク面積を内部標準のものと比較することによって計算され、リットル当たりミリモルとして表された。

2.5統計分析

特に記載のない限り、p<0.05で有意性を決定するために、一方向分散分析(接種物、定常状態対、TS)を用いて統計分析

3の結果

3。1バッチ培養

接種前に、サンプルにはほぼ同じ数のBifidobacterium sppが含まれていました。、Bacteroides spp. およびClostridium spp. 乳酸菌はあまり多くなかった。 Α−laを含有する培養物では(図1 0b)。 1)、総カウント、ビフィズス菌、クロストリジウム、乳酸菌およびバクテロイデスは変化しなかった。 E.coli数は、6時間インキュベーション後のα−la補充で有意に減少したが(P<div i d=”a7bd6affbb”></div>0.1

1

平均細菌数(log10)成人糞便接種および1%(w/w)ラクトース)または1%(w/w)試験式を含む基礎培地を含むバッチ培養における。 N=糞便接種物;2 4時間、ラクトース=ラクトースを含有する培養2 4時間後の培養;2 4時間、α−l A/GMP=α−l AまたはGMPを含有する培養2 4時間後の培養である。1%(w/w)ラクトース)または1%(w/w)試験式を含む基礎培地を含む成人糞便接種物およびバッチ培養における平均細菌数(log10)。 N=糞便接種物;2 4時間、ラクトース=ラクトースを含有する培養2 4時間後の培養;2 4時間、α−l A/GMP=α−l AまたはGMPを含有する培養2 4時間後の培養である。

GMPを含む培養物(図10)。 1)ビフィズス菌、Bacteroides、乳酸菌およびclostridiaの一般に維持された数。 E.coli数は、インキュベーションの6時間後に有意に減少したが(P<div id=”a7bd6affbb”></div>0.

3.2二段化合物連続培養システム

同じ標準培地(1%w/wラクトースを含む基礎培地、図。 2)、総細菌数、ビフィズス菌、乳酸菌、およびクロストリジウムは一定のままであった。 対照的に、バクテロイデスは、平衡後の両方の発酵容器で有意に増加し、両方の容器の定常状態で接種物レベルよりも高いままであった(P<0.05)。 統計的に有意な減少(P<0.05)は、平衡化後の容器2(pH6.5)中の大腸菌について観察することができた。 しかし、これは維持されず、両方の血管は、接種物よりも低かった定常状態で同等の大腸菌レベルを有していた。

2

1%(w/w)ラクトースまたは母乳(BM)を含む基礎培地を有する糞便接種器および対照発酵槽容器における平均細菌数(log10)。 N=糞便接種物;v1TS=定常状態での容器1(pH5.

2

1%(w/w)乳糖または母乳(BM)を含む基礎培地を有する糞便接種器および対照発酵槽容器における平均細菌数(log10)。 N=糞便接種物;v1TS=定常状態での容器1(pH5.

母乳を含む血管の後(図。 2)を24時間平衡させたままにし、統計的に有意な増加(P<0.05)が容器2(pH6.5)、定常状態に達するまで保持された。 ビフィズス菌の数は安定したままであった。 対照的に、クロストリジウムは、両方の血管で有意に減少し(P<0.01)、定常状態で容器1(pH5.2)から完全に消失した。 同様の減少(P<0.05)は、容器1(pH5.2)では大腸菌で観察されたが、容器2(pH6.5)では観察されなかった。 Α−laを含有し、1ヶ月齢および3ヶ月齢の乳児から得られた糞便試料を接種した血管は、安定した総計数ならびに他の細菌のレベルを有していた( 発酵槽に6ヶ月の乳児から得られた糞便標本を接種したとき(Fig. 3)、総カウントおよび乳酸菌のカウントは変わらなかったです。 Bacteroides、clostridiaおよびe.coliの数は平衡化後に著しく減少し、統計的に有意な減少(P<0.05)は両方のpHレベルで観察された。 GMPを含み、1ヶ月と3ヶ月の乳児から糞便サンプルを接種した血管は、変動するが、安定したままの総カウント、Bacteroidesと大腸菌を持っていた。 Α-l Aで観察されたように、乳酸菌は初期試料と比較してわずかに上昇傾向を示したが、統計的有意性は観察されなかった(図示せず)。 発酵槽に6ヶ月の乳児からの糞便を接種したとき(Fig. 3)、総カウント、乳酸菌およびビフィズス菌は変化しなかった。 Bacteroides、clostridiumおよび大腸菌の数は平衡後に著しく減少し、統計的に有意な減少(P<0.05)は、α-la補填式で見られるものと同様に、両方のpHレベルで観察された。

3

6ヶ月のドナーの糞便を使用して、α-laまたはGMPを含む接種器および発酵槽容器(log10)における平均細菌数。 N=糞便接種物;v1TS=定常状態での容器1(pH5.

3

6ヶ月齢のドナーの糞便を使用して、α-laまたはGMPを含む接種器および発酵槽容器(log10)における平均細菌数。 N=糞便接種物;v1TS=定常状態での容器1(pH5.2)、V1TS=定常状態での容器1(ph5.2)、V1TS=定常状態での容器1(ph5.2)、V1TS=定常状態での容器1(ph5.2)、V1TS=; V2TS=定常状態での容器2(pH6.5)。

3.3有機酸

有機酸の総量は、接種とサンプル時間の間で有意に統計的に変化した(P<0.05)、接種の平均総酸は4.28mmol l−1、8.16mmol l−1、15.64mmol l−1であり、73.80mmol/l−1(範囲18.93mmol/l–1)であった。39.29mmol L−1(範囲15.30–100.28)および80.49mmol l−1(範囲28.07–177.34)1ヶ月、3ヶ月および6ヶ月のドナーそれぞれ。 標準エラーは次のとおりでした4.96%, 3.10%, 2.61%, 1.80%, 0.91%, 0.84%, 1.91% と5.アセテート、プロピオン酸塩、i酪酸塩、n酪酸塩、i吉草酸塩、n吉草酸塩、caproateおよび乳酸塩のためのそれぞれ12%。 酢酸は、すべての群において優勢な酸であった(図4)。 4)乳酸塩およびプロピオン酸塩に先行して、それぞれ63%、21%、総酸の11%を平均します。 d(-)-乳酸は、散発的かつ最小限の量でのみ発生したl(+)-乳酸と比較して主に発見された。 微量で発生した等酸,吉草酸およびカプロエートの研究群間に統計的に有意な差はなかった。

4

発酵槽内の酸の相対量(%)を意味します。 食事療法:N=接種物;a-la(α-la)=αラクトアルブミン;GMP=glycomacropeptide;BM=母乳。 ドナー年齢:1=1ヶ月;3=3ヶ月;出生後6=6ヶ月。

4

発酵槽内の酸の相対量(%)を意味します。 食事療法:N=接種物;a-la(α-la)=αラクトアルブミン;GMP=glycomacropeptide;BM=母乳。 ドナー年齢:1=1ヶ月;3=3ヶ月;出生後6=6ヶ月。しかし、統計的に有意な差がありました(P<0。05)主要酸とn-酪酸の相対量については、基の間にある。 酢酸と乳酸は、一般的に乳酸が優勢であった6ヶ月の乳児の接種物を除いて3:2の比率で発生した(P<0.01)。 n-酪酸濃度は一般にドナー年齢とともに増加したが,プロピオン酸は両方の濃度がほぼ等しいまで減少した。 少量のi-酪酸もすべてのドナー年齢群および母乳群に見出された。

4ディスカッション

これまでの研究に基づいて、母乳育児の乳児は、ビフィズス菌および/または乳酸桿菌によって数値的に支配されている微生物叢の恩恵を受ける可能性があると一般的に考えられている。 α-L aおよびGMPは,invitroでビフィズス菌の選択された純粋培養を有意に刺激することが以前に見出された。 しかし、ここでは混合培養では同様の結果は見られなかった。 成体糞便材料を接種した予備バッチ培養では,有益な微生物叢に対する統計的に有意な効果は観察されなかった。 同じことは、様々な年齢層の乳児からの糞便材料を接種した連続培養で使用された場合、両方のサプリメントにも当てはまりました。 それにもかかわらず、ビフィズス菌は試験式と母乳コントロールの両方で支配的なグループであり、ビフィズス菌も実験を通して一定のままであった。 乳酸菌にはより深い効果が見られた。 母乳は乳酸桿菌を有意に増加させた。 乳酸菌数のマイナーな、しかし統計的に重要でない上昇は、3ヶ月の乳児の糞便中のGMPで示された、6ヶ月の乳児の糞便材料を用いた実験で継続した傾向。

両方の式サプリメントはまた、病原体の様々ないくつかの阻害効果を有すると考えられています。 GMPは,n-アセチルノイラミン酸(シアル酸)を含む炭水化物鎖とポリペプチド部分にいくつかの抗病原性属性を有することが以前に示された。 腸の細胞の表面のシアル酸の存在は頻繁にいろいろな腸病原体の伝染に要求され、GMPの外因性の源は伝染のために必要である細菌の付着を禁 これは、ヒト腸細胞株への腸病原性大腸菌の付着を阻害することによって川上によって実証されている。 一般に、シアル酸含有成分の濃度は、乳児用調製粉乳よりもヒトミルク中で高い。 Bacteroides、clostridiaおよびEに対するGMPの抑制的な効果。 この研究では、病原性の可能性のある3つの生物である大腸菌が観察されました。 成体糞便物質数を用いた予備バッチ培養では一般的に保存されたが、連続培養では減少傾向が見られた。 しかし、これらの生物の統計的に有意な減少は、6ヶ月の乳児の糞便材料を実行している文化でのみ検出された。 同様の結果が母乳で観察され、クロストリジウムおよび大腸菌を有意に減少させたが、バクテロイデスは変化しなかった。 対照的に,基礎培地はバクテロイデスのレベルを有意に増加させ,フローラの組成の変化はウォッシュアウトの結果ではなく,発酵培地に依存することを示した。

ラクトースシンターゼの調節成分であるα-Laは、c型リゾチームと高いレベルの配列同一性を共有し、共通の祖先遺伝子から来たことを示唆する同様の三次元構造を有する。 いくつかの研究が、α−laが病原体に対して同様の効果を有する可能性があることを示唆するために実施されている。 対照的に、Pelligrini e t a l. トリプシンとペプシンによるタンパク質分解消化は,主にグラム陰性生物に対して活性な殺菌特性を有する三つのペプチドを得た。 加水分解α-l aの静菌特性は大腸菌に対して特異的に見られた。 Bacteroides,clostridiaおよびe.coliに対するα-l aの阻害効果を観察した。 再び、これらの生物の統計的に有意な減少は、6ヶ月齢の乳児の糞便材料を実行している培養物でのみ検出され、母乳対照のために得られた結果と同

私たちの研究は、酢酸がプロピオン酸塩の低濃度と人生の最初の117日間で酪酸のほぼ完全な不在と一緒に瓶飼育の乳児と比較して、母乳で主なSCFA 乳酸塩および酢酸塩は一般にRasicおよびKurmannによって記述されているようにmicrofloraのbifidobacteriaの優勢な役割を確認する2:3の比率で起こった。 乳酸塩の高い発生はまた母乳で育てられた赤ん坊で見られるように一般に酸pHと関連付けられる不完全なか急速な発酵の典型的です。 しかし、母乳を発酵させた母乳ドナーの糞便接種物が乳酸をほぼ完全に欠いた酸プロファイルを生成したため、これはここでは確認されなかった。 一方,α-l a-およびGMP添加式を発酵させた糞便試料は,n-酪酸の高濃度で式発酵の酸プロファイル特性を生成し,これはドナー年齢とともに増加した。 但し、アセテートはまだ専ら母乳で育てられた幼児で見られるように優勢に残りました。要約すると、我々は、α-laおよびGMPによる乳児用調製粉乳の補給の微生物学的効果を示している。

ビフィズス菌の純粋培養を用いた以前のinvitro研究と比較して,糞便接種を用いた二つのサプリメントのビフィズス菌効果は観察されなかった。 しかし、潜在的に病原性微生物叢の統計的に有意な減少が観察され、これは母乳育児で観察されたものと同様であった。 したがって、この文脈では、多量の酢酸と組み合わせたα−l AおよびGMP補給は、ヒト微生物叢に対して有益な効果を有すると結論することができる。

謝辞

研究者たちは、Alethea Hill夫人とドナーとその両親に、研究のための支援、熱意、貴重な助けに感謝したいと思います。

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