Utilizzo di batch di cultura e di due stadi di continuo sistema di coltura per studiare l’effetto di supplementare alfa-lattoalbumina e glycomacropeptide su popolazioni miste di intestino, i batteri

Abstract

Alcune latte di fattori in grado di promuovere la crescita di un host-friendly microflora gastrointestinale. Questo può spiegare perché i neonati allattati al seno sperimentano meno infezioni intestinali rispetto ai loro omologhi alimentati con formula. L’effetto della supplementazione di formula con due di questi fattori è stato studiato in questo studio. Campioni fecali infantili sono stati utilizzati per fermentare formule integrate con glicomacropeptide e α-lattoalbumina in un modello di coltura continua composto a due stadi. La batteriologia è stata determinata mediante ibridazione in situ a fluorescenza. I vasi che contenevano latte materno così come α-lattoalbumina e glicomacropeptide avevano conteggi stabili di bifidobatteri mentre i lattobacilli aumentavano significativamente solo nei vasi con latte materno. Bacteroides, clostridi ed Escherichia coli sono diminuiti significativamente in tutte le esecuzioni. L’acetato era l’acido principale trovato con gli importi elevati del proponiato e del lattato. L’integrazione di formule per lattanti con proteine del latte appropriate può essere utile per simulare gli effetti batteriologici benefici del latte materno.

1 Introduzione

L’intestino crasso umano è un ecosistema complesso che ospita una vasta gamma di batteri. Si ritiene che almeno 400 diverse specie batteriche siano presenti in qualsiasi momento, con un massimo di 1012 batteri trovati per g di feci . La microflora viene acquisita alla nascita, con il neonato sterile che viene colonizzato da vari batteri durante il processo di parto . Durante i primi giorni di vita predominano procarioti nutrizionalmente poco esigenti come enterobatteri, stafilococchi e streptococchi (compresi gli enterococchi). Entro la prima settimana di vita, generi come bifidobatteri e Bacteroides si stabiliscono . Si pensa che i neonati allattati al seno abbiano una flora del colon che è numericamente dominata dai bifidobatteri, mentre quelli che sono nutriti con formula hanno microbiota più complessi che sono simili nella composizione a quelli degli adulti . I bifidobatteri possono esercitare potenti effetti antimicrobici contro una varietà di agenti patogeni intestinali come alcune enterobacteriaceae e Clostridium spp. Come tale, una predominanza di bifidobatteri è visto come un indicatore di miglioramento della salute dell’intestino . Le osservazioni sulla normale microflora intestinale sono state in gran parte derivate dalla coltura quantitativa delle placche e dalla caratterizzazione fenotipica, che presentano limitazioni in termini di efficienza di recupero e soggettività dell’operatore .

Inoltre, poiché il colon prossimale è fisicamente inaccessibile per scopi di routine, la maggior parte degli studi microbici sulla fermentazione sono stati effettuati con batteri fecali in coltura batch o chemostati a stadio singolo . La coltura in batch consente di determinare la fermentabilità di vari substrati durante brevi periodi (24 h). Tuttavia, esistono marcate differenze nella disponibilità del substrato e nelle condizioni ambientali tra il colon prossimale e distale, che non possono essere simulate in un singolo sistema di vasi .

Al contrario, i sistemi in vitro che utilizzano più recipienti di fermentazione allineati in serie presentano vantaggi in quanto sono in grado di modellare condizioni ambientali più complesse consentendo l’eterogeneità spaziale e temporale . Ad esempio, è stato dimostrato che un chemostato a due stadi con riciclaggio cellulare dal secondo al primo stadio produce risultati soddisfacenti . Ulteriori perfezionamenti per modellare il colon umano adulto sono stati effettuati da Macfarlane et al. utilizzando un sistema di coltura continua composto a tre stadi. Questo è stato convalidato microbiologicamente contro il materiale umano del colon ottenuto da vittime di morte improvvisa all’autopsia. Tali modelli sono preziosi per studiare la microflora intestinale poiché possono essere controllate diverse condizioni fisico-chimiche. Questo ha chiari vantaggi economici, ma è particolarmente rilevante per la pianificazione di studi sull’uomo.

Le differenze nella flora fecale si riflettono anche in vari modelli di lattato, acido grasso a catena corta (SCFA) e ramificata che sono prodotti intermedi e finali della fermentazione batterica . Il loro tasso di produzione e il modello di fermentazione possono anche essere determinati dalla disponibilità di substrato per la flora batterica intestinale . Pertanto, i cambiamenti nella flora fecale da un’alterazione nella dieta, o terapia antimicrobica, possono anche portare a un cambiamento nei modelli di fermentazione e nella concentrazione di acido organico . La quantità di tali acidi prodotti nei soggetti umani è difficile da determinare e solo un piccolo numero di studi sono stati effettuati che indicano che negli adulti, tra 300 mmol e 1-2 mol di acido sono prodotti ogni giorno. L’acetato è risultato essere il principale SCFA prodotto in tutti i casi e le prove suggeriscono che le concentrazioni di SCFA cecale sono circa il doppio di quelle nell’area recto-sigmoidea .

Due componenti del latte hanno precedentemente dimostrato di inibire le infezioni gastrointestinali e/o di stimolare i bifidobatteri in vitro. Il glicomacropeptide (GMP), un derivato della κ-caseina, è stato ampiamente studiato in vitro e ha dimostrato di inibire l’adesione di batteri, virus e tossine alla membrana cellulare attraverso il legame con i siti recettoriali del patogeno . Questi test in vitro hanno anche dimostrato che GMP ha fortemente promosso la crescita di Bifidobacterium breve, B. bifidum, B. infantis e Lactococcus lactis. l’α-lattoalbumina (α-la), che ha una struttura terziaria paragonabile ai lisozimi di tipo c, ha dimostrato di avere effetti simili . Pihlanto-Leppälä et al. in precedenza ha dimostrato che α-la abbassato l’attività metabolica di Escherichia coli JM103 a solo il 21% del normale. Inoltre, il test del latte vaccino purificato ha dimostrato che α-la era un potente promotore di crescita per B. infantis e B. breve.

In questo studio, abbiamo utilizzato la coltura batch e un sistema di coltura continua composto a due stadi per testare le proprietà di fermentazione e le attività batteriche dopo la supplementazione di alimenti per lattanti con α-la e GMP. Il sistema di coltura continua è stato adattato dal modello a tre stadi sviluppato da Macfarlane et al. . Il suo volume operativo più piccolo e i tassi di turnover più rapidi hanno tentato di spiegare i fattori fisici trovati nei neonati umani. Abbiamo testato se l’integrazione di α-la e GMP può alterare la flora gastrointestinale per dare benefici simili a quelli osservati nei neonati allattati al seno.

2 Materiali e metodi

2.1 Coltura batch

Per i sistemi di coltura batch anaerobici, il terreno di coltura basale contenuto (per litro): 1 g peptone, 1 g estratto di lievito, 0,05 g NaCl, 0,02 g K2HPO4, 0,02 g KH2PO4, 0,005 g MgSO4·7H2O, NaHCO3, 1 ml Tra 80, 0.0025 g haemin, 5 µl vitamina K1, 0,25 g cisteina HCl e 0,25 g sali biliari disciolti in 500 ml di acqua deionizzata, regolati a pH 7,0 e sterilizzati in autoclave. Tutte le sostanze chimiche sono state ottenute da Sigma (Poole, Dorset, UK) se non diversamente specificato. Il mezzo sterile (50 ml) è stato posto in flaconi di coltura batch da 100 ml contenenti 0,5 g (1% p/v) di una formula di prova (Arla Foods Ingredients, Viby, Danimarca) integrata con α-la (68% p/v) o GMP (80% p/v) e mantenuta in un’atmosfera di gas azoto privo di ossigeno. Le formule sono state confrontate con uno standard contenente l ‘ 1% (p/p) di lattosio. Il giorno seguente, un campione fecale fresco è stato raccolto in un sacchetto stomacher ed elaborato immediatamente. L’esperimento è stato ripetuto cinque volte utilizzando cinque diversi donatori.

I recipienti di coltura per lotti sono stati inoculati con 5 ml di liquame fecale al 10% (p/v) da volontari adulti sani preparati con soluzione salina tamponata con fosfato anaerobico (PBS, 0,1 M, pH 7,2) e i campioni da 1 ml sono stati prelevati a volte 0 (prima dell’immissione del campione in coltura per lotti), 6 h e 24 h e conservati a 4°C fino a nuovo utilizzo. Per il conteggio dei batteri mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH), 375-µl triplica del campione raccolto è stato rimosso e aggiunto a 1,5 ml provetta Eppendorf contenente 1125 µl di filtro, sterilizzati 4% (w/v) paraformaldeide in PBS (pH 7,2) e fissa per almeno 4 h a 4°C. Il fisso campione è stato quindi centrifugato per 5 min a 13 000×g e il surnatante eliminato. Il pellet è stato risospeso in 1 ml di PBS filtrato (pH 7,4) contenente 0,00001% (p/v) di cetil trimetilammonio bromuro e trasferito in un tubo di Eppendorf per repellenza (13 000×g, 5 min). Dopo aver lavato il pellet una seconda volta, il surnatante è stato rimosso e il pellet risospeso accuratamente in 150 µl di PBS filtrato e 150 µl di etanolo al 96% (v/v). Il campione è stato miscelato bene e conservato a -20°C per almeno 1 ora prima dell’ibridazione con una sonda fluorescente (come descritto di seguito).

2.2 Sistema a coltura continua a due stadi

Il sistema a coltura continua era costituito da due recipienti di vetro, V1 e V2, entrambi con un volume operativo di 100 ml. Temperatura (37°C) e pH sono stati controllati automaticamente. Il pH della coltura nei vasi era 5.2 in V1, che rappresenta l’ambiente a basso pH del colon prossimale e 6.5 in V2, indicativo di un pH più neutro nel colon distale. Ogni fermentatore è stato mescolato magneticamente e il mezzo di crescita è stato continuamente cosparso di azoto privo di ossigeno (15 ml min-1) e alimentato da un serbatoio di vetro tramite una pompa peristaltica (Watson−Marlow, Falmouth, UK) a V1. V1 sequenzialmente fornito V2 tramite un overflow e una serie di dighe. L’overflow da V2 è stato portato a un contenitore di rifiuti. Il mezzo di coltura consisteva in (A) il mezzo basale descritto sopra con 1% (w/v) lattosio aggiunto (Sigma, Poole, Dorset, UK), (B) latte materno umano (fornito dal Royal Berkshire Hospital, Reading, UK) con 0,5 g l−1l-cisteina-HCl aggiunto, (C) formula di prova con 68% (w/v) α-la supplementare, 1% (w/v) lattosio e 0,5 g l−1l-cisteina-HCl, (p/v) GMP, 1% (p/v) lattosio e 0,5 g l−1l-cisteina-HCl. Tutte le formule sono state ottenute da ingredienti Arla Foods (Viby, Danimarca) e predigerite utilizzando pepsina (575 U per g di proteine) a pH 2 per 2 h (37°C), seguita da pancreatina (50 U per g di proteine) e 0,5 g l−1 volume di acido biliare a pH 6,5 per due h (37°C). Per garantire l’anaerobicità, 4 ml l−1 di una soluzione madre l−1 da 250 mg di resazurina sono stati bolliti e aggiunti al mezzo. I mezzi sono stati quindi riscaldati a 80°C per 20 min, raffreddati a temperatura ambiente durante la notte e riscaldati a 80°C per altri 20 min prima di essere continuamente disseminati di N2 senza O2. Il sistema è stato azionato a un tempo di ritenzione (R) di 12 ore calcolato come tasso reciproco di diluizione. Il tempo di ritenzione del sistema costituiva la somma dei singoli valori R in ciascun fermentatore. Ogni fermentatore è stato inoculato con 15 ml di un liquame fecale fresco al 10% (p/v) da donatori di neonati sani di età compresa tra 1 e 6 mesi e alimentato con latte materno con formula supplementare. La sospensione è stata preparata utilizzando 0,1 M PBS anaerobico (pH 7,2). Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti cinque volte utilizzando diversi donatori ad eccezione del gruppo B (latte materno), dove l’esperimento è stato effettuato una volta utilizzando il materiale fecale di un donatore di 3 mesi, esclusivamente allattato al seno. I gruppi C e D contenevano ciascuno cinque individui diversi. I campioni sono stati prelevati dopo 1, 3 e 6 mesi di età al fine di valutare eventuali differenze nella microflora fecale e qualsiasi cambiamento nell’efficacia degli integratori man mano che i bambini maturavano. Il sistema di fermentazione è stato permesso di equilibrare durante la notte prima che la pompa media è stata avviata, ed è stato eseguito per almeno 144 h per stabilire condizioni di stato stazionario. sono stati prelevati e preparati campioni da 3 ml dell’inoculo originale (N), dopo equilibrazione (T0) e allo stato stazionario (TS) per l’analisi dei PESCI come descritto sopra.

2.3 Enumerazione batterica attraverso i PESCI

Sonde oligonucleotidiche (Tabella 1) per Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp./ Enterococcus, Bacteroides spp. , Clostridium histolyticum group ed E. i coli sono stati sintetizzati e monomarcati all’estremità 5 ‘ con Cy3 (Ex 552 nm, Em 568 nm) da Eurogentec (Abingdon, UK) o MWG-Biotech (Milton Keynes, UK). L’ibridazione è stata effettuata durante la notte a 50°C per Bifidobacterium e Clostridium, a 45°C per Lactobacillus e Bacteroides e a 37°C per E. coli. Per l’ibridazione, 200 µl di tampone filtrato (40 mM Tris–HCl pH 7,2, 1,8 M NaCl) contenente 20 ml l−1 di SDS al 10% (p/v) e 64 µl di acqua di qualità HPLC sono stati aggiunti a 16 µl di celle fisse e riscaldati alla temperatura appropriata. La soluzione di ibridazione pre-riscaldata (90 µl) è stata aggiunta a 10 µl della sonda appropriata (concentrazione finale 50 ng µl−1) e la soluzione incubata durante la notte in un forno di ibridazione. Per la sonda E. coli, 264 µl di tampone di ibridazione contenente il 35% (v/v) di formammide sono stati aggiunti a 16 µl di cellule fisse. Le cellule sono state lavate aggiungendo 5 ml di tampone di lavaggio (20 mM Tris-HCl pH 7,2, 0,9 M NaCl) a 5-100 µl di campione ibridato, colorate con 20 µl 4’,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, Ex 344, Em 450; 500 ng ml−1) e incubate in un forno di ibridazione per 30 min. Per i conteggi totali, 5-12 µl di campione sono stati filtrati sotto vuoto su un filtro in policarbonato a pori di 0,2 µm (Millipore, Watford, UK) e posizionati su un vetrino da microscopio. Per evitare lo sbiadimento delle sonde, è stata aggiunta al filtro una goccia di SlowFade-Light Antifade Kit component A (Molecular Probes Europe, Leiden, Paesi Bassi). I vetrini sono stati esaminati al microscopio utilizzando un attacco a EPI-fluorescenza (Nikon UK, Kingston upon Thames, UK). La luce UV è stata utilizzata per contare i batteri macchiati DAPI e le cellule macchiate Cy3 sono state enumerate a 550 nm. Quindici campi casuali con una buona distribuzione di celle (10-100) sono stati contati per ogni sonda e campione.

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Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

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Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

2.4 Volatile acid analysis

Undiluted aliquots (1.0 ml) di campione sono stati erogati in provette Eppendorf da 1,5 ml e centrifugati (13 000×g, 5 min) ai batteri del pellet e ad altri solidi. Il surnatante è stato quindi filtrato utilizzando un filtro in policarbonato da 0,2 µm e aggiunto a quattro parti di acetonitrile contenente 4,3 mmol l-1 di acido 2-etilbutirrico come standard interno. La calibrazione è stata eseguita utilizzando soluzioni standard di acido acetico, acido propionico, acido i-butirrico, acido n-butirrico, acido i-valerico, acido n-valerico, acido n-caproico e acido dl-lattico in acetonitrile. Gli acidi grassi sono stati determinati mediante cromatografia gas-liquido su un sistema GC della serie Agilent 6890 (Agilent, Waldbronn, Germania) dotato di una colonna Optima FFAP (25 m×0,32 mm, Macherey-Nagel, Düren, Germania) e di un rivelatore a ionizzazione di fiamma. Il gas vettore elio è stato erogato ad una portata di 1,8 ml min-1. Iniettore, colonna e rivelatore sono stati impostati rispettivamente a 220°C, 140°C (isotermico) e 220 ° C. Dopo 5 min la temperatura della colonna è stata aumentata a 240 ° C con incrementi di 20°C min−1 per funzionare per altri 15 min. I picchi sono stati integrati utilizzando un PC con software di gestione Atlas Lab (Thermo Lab Systems, Mainz, Germania). Le concentrazioni di acidi grassi sono state calcolate confrontando le loro aree di picco con quelle dello standard interno e sono state espresse in millimoli per litro.

2.5 Analisi statistica

L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando unidirezionale ANOVA (inoculum, versus steady-state, TS) per determinare la significatività a P<0.05 se non diversamente specificato.

3 Risultati

3.1 Coltura in lotti

Prima dell’inoculazione, i campioni contenevano un numero quasi identico di Bifidobacterium spp., Bacteroides spp., e Clostridium spp. I lattobacilli erano meno numerosi. In colture contenenti α-la (Fig. 1), conteggi totali, bifidobatteri, clostridi, lattobacilli e Bacteroides sono rimasti invariati. La conta di E. coli è diminuita significativamente (P<0,01) con la supplementazione di α-la dopo 6 ore di incubazione, ma è aumentata nuovamente ai livelli basali (non mostrati).

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Conta batterica media (log10) in inoculo fecale adulto e colture batch contenenti terreno basale con formula di prova dell ‘1% (p/p) di lattosio) o dell’ 1% (p / p). I risultati sono mezzi (log10 per g di peso umido)±S. D. N=inoculo fecale; 24 h, lattosio = coltura dopo 24 h di incubazione contenente lattosio; 24 h, a-la/GMP=coltura dopo 24 h di incubazione contenente α-la o GMP.

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Conta batterica media (log10) in inoculo fecale adulto e colture batch contenenti terreno basale con formula di prova dell ‘1% (p / p) di lattosio) o dell’ 1% (p / p). I risultati sono mezzi (log10 per g di peso umido)±S. D. N=inoculo fecale; 24 h, lattosio = coltura dopo 24 h di incubazione contenente lattosio; 24 h, a-la/GMP=coltura dopo 24 h di incubazione contenente α-la o GMP.

Colture contenenti GMP (Fig. 1) generalmente mantenuto il numero di bifidobatteri, Bacteroides, lattobacilli e clostridi. La conta di E. coli è diminuita significativamente (P<0,05) dopo 6 ore di incubazione ma, ancora una volta, è aumentata a livelli basali (non mostrato).

3.2 Sistema di coltura continua composto a due stadi

In recipienti contenenti lo stesso mezzo standard (mezzo basale contenente 1% p / p di lattosio, Fig. 2), conteggi batterici totali, bifidobatteri, lattobacilli e clostridi sono rimasti costanti. Al contrario, i Bacteroides sono aumentati significativamente in entrambi i vasi di fermentazione dopo l’equilibrio e sono rimasti più alti dei livelli di inoculo allo stato stazionario in entrambi i vasi (P<0,05). Una diminuzione statisticamente significativa (P< 0,05) potrebbe essere osservata per E. coli nel recipiente 2 (pH 6,5) dopo l’equilibrazione. Tuttavia, questo non è stato mantenuto ed entrambi i vasi avevano livelli di E. coli comparabili allo stato stazionario, che erano inferiori all’inoculo.

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Conta batterica media (log10) in inoculo fecale e vasi fermentatori di controllo con terreno basale contenente l ‘ 1% (p / p) di lattosio o latte materno (BM). I risultati sono medi (log10 per g di peso umido)±S. D. N=inoculo fecale; V1TS = vaso 1 allo stato stazionario (pH 5.2); V2TS=vaso 2 allo stato stazionario (pH 6.5).

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Conta batterica media (log10) in inoculo fecale e vasi fermentatori di controllo con terreno basale contenente l ‘ 1% (p / p) di lattosio o latte materno (BM). I risultati sono medi (log10 per g di peso umido)±S. D. N=inoculo fecale; V1TS = vaso 1 allo stato stazionario (pH 5.2); V2TS=vaso 2 allo stato stazionario (pH 6.5).

Dopo i vasi contenenti latte materno (Fig. 2) sono stati lasciati in equilibrio per 24 ore, un aumento statisticamente significativo (P<0,05) è stato osservato per i lattobacilli nel vaso 2 (pH 6.5), che è stato mantenuto fino al raggiungimento dello stato stazionario. La conta dei bifidobatteri è rimasta stabile. Al contrario, i clostridi sono diminuiti (P<0,01) in modo significativo in entrambi i recipienti e sono scomparsi completamente dal recipiente 1 (pH 5,2) allo stato stazionario. Diminuzioni simili (P<0,05) sono state osservate per E. coli nel recipiente 1 (pH 5,2) ma non nel recipiente 2 (pH 6,5). I recipienti contenenti α-la e inoculati con campioni fecali ottenuti da neonati di 1 e 3 mesi avevano una conta totale stabile e livelli di altri batteri (non mostrati). Quando i fermentatori sono stati inoculati con campioni fecali ottenuti da neonati di 6 mesi (Fig. 3), la conta totale e la conta dei lattobacilli sono rimaste invariate. La conta dei bacteroides, dei clostridi e degli E. coli è diminuita notevolmente dopo l’equilibrazione ed è stata osservata una riduzione statisticamente significativa (P<0,05) ad entrambi i livelli di pH. I vasi contenenti GMP e inoculati con campioni fecali di neonati di 1 e 3 mesi avevano conteggi totali, Bacteroides ed E. coli che oscillavano ma rimanevano stabili. Come osservato con α-la, i lattobacilli hanno mostrato una leggera tendenza al rialzo rispetto ai campioni iniziali, ma non è stata osservata la significatività statistica (non mostrata). Quando i fermentatori sono stati inoculati con feci di bambini di 6 mesi (Fig. 3), conteggi totali, lattobacilli e bifidobatteri sono rimasti invariati. I conteggi di Bacteroides, clostridium e E. coli sono diminuiti notevolmente dopo l’equilibrio e una riduzione statisticamente significativa (P<0.05), simile a quella osservata con la formula integrata con α-la, è stata osservata ad entrambi i livelli di pH.

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Conta batterica media nei vasi inoculari e fermentatori (log10) contenenti α-la o GMP utilizzando feci di donatori di 6 mesi. I risultati sono medi (log10 per g di peso umido)±S. D. N=inoculo fecale; V1TS = vaso 1 allo stato stazionario (pH 5.2); V2TS=vaso 2 allo stato stazionario (pH 6.5).

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Conta batterica media in vasi inoculari e fermentatori (log10) contenenti α-la o GMP utilizzando feci di donatori di 6 mesi. I risultati sono medi (log10 per g di peso umido)±S. D. N=inoculo fecale; V1TS = vaso 1 allo stato stazionario (pH 5.2); V2TS = recipiente 2 allo stato stazionario (pH 6,5).

3.3 acidi Organici

quantità Totale di acidi organici varia in modo significativo statisticamente (P<0,05) tra i inoculi e gli orari di esempio con una media totale di acido per il inoculi di essere 4.28 mmol l−1, 8.16 mmol l−1 e 15.64 mmol l−1 rispetto a 73.80 mmol/l−1 (range 18.93–160.49), 39.29 mmol l−1 (range 15.30–100.28) e 80.49 mmol l−1 (range 28.07–177.34) per 1, 3 e 6-mese-vecchio donatori rispettivamente. Gli errori standard erano 4.96%, 3.10%, 2.61%, 1.80%, 0.91%, 0.84%, 1.91% e 5.12% per acetato, propionato, i-butirrato, n-butirrato, i-valerato, n-valerato, caproato e lattato rispettivamente. L’acetato era l’acido predominante in tutti i gruppi (Fig. 4) seguito da lattato e propionato, con una media rispettivamente del 63%, 21%, 11% dell’acido totale. d (-) – lattato è stato trovato prevalentemente rispetto a l (+) – lattato che si è verificato solo sporadicamente e in quantità minime. Non sono state riscontrate differenze statisticamente significative tra i gruppi di studio per isoacidi, valerato e caproato, che si sono verificate in tracce.

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Quantità relative medie (%) di acido nei vasi fermentatori. Diete: N=inoculo; a-la (α-la)=α-lattoalbumina; GMP=glicomacropeptide; BM = latte materno. Età del donatore: 1 = 1 mese; 3 = 3 mesi; 6=6 mesi dopo la nascita.

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Quantità relative medie (%) di acido nei vasi fermentatori. Diete: N=inoculo; a-la (α-la)=α-lattoalbumina; GMP=glicomacropeptide; BM = latte materno. Età del donatore: 1 = 1 mese; 3 = 3 mesi; 6=6 mesi dopo la nascita.

C’era, tuttavia, una differenza statisticamente significativa (P < 0.05) tra i gruppi per le quantità relative dei principali acidi e n-butirrato. Acetato e lattato generalmente si sono verificati in un rapporto di 3:2 con l’eccezione dell’inoculo dei bambini di 6 mesi, dove il lattato predominava (P<0,01). le concentrazioni di n-butirrato generalmente aumentavano con l’età del donatore mentre il propionato diminuiva fino a quando entrambi erano circa uguali in concentrazione. Piccole quantità di i-butirrato sono state riscontrate anche in tutti i gruppi di età dei donatori e nel gruppo del latte materno.

4 Discussione

Sulla base di studi precedenti, si ritiene generalmente che i neonati allattati al seno possano trarre beneficio dal microbiota che è numericamente dominato da bifidobatteri e / o lattobacilli . α-La e GMP sono stati precedentemente trovati per stimolare significativamente selezionate colture pure di bifidobatteri in vitro. Tuttavia, risultati simili non sono stati visti qui nella cultura mista. Nelle colture batch preliminari inoculate con materiale fecale adulto, non è stato osservato alcun effetto statisticamente significativo sulla microflora benefica. Lo stesso era vero per entrambi gli integratori quando utilizzati in coltura continua inoculata con materiale fecale da neonati di varie fasce d’età. Nonostante ciò, i bifidobatteri erano il gruppo dominante sia nelle formule di prova che nel controllo del latte materno, dove anche i bifidobatteri sono rimasti costanti durante l’esperimento. Un effetto più profondo è stato visto per i lattobacilli. Il latte materno ha aumentato significativamente i lattobacilli. Un aumento minore, ma statisticamente insignificante, della conta dei lattobacilli è stato mostrato con GMP nelle feci di neonati di 3 mesi, una tendenza che è proseguita negli esperimenti con materiale fecale di neonati di 6 mesi.

Entrambi i supplementi di formula inoltre sono pensati per possedere un certo effetto inibitorio su vari agenti patogeni. GMP precedentemente è stato indicato per avere parecchi attributi anti-patogeni sia nella sua catena del carboidrato che contiene l’acido N-acetilneuraminic (acido sialico) come pure nella sua porzione del polipeptide . La presenza di acidi sialici sulla superficie delle cellule intestinali è spesso necessaria per l’infezione di una varietà di agenti patogeni enterici e una fonte esogena di GMP potrebbe inibire l’adesione batterica, che è essenziale per l’infezione. Ciò è stato dimostrato da Kawakami inibendo l’aderenza di E. coli enteropatogeno alle linee cellulari intestinali umane. Generalmente, la concentrazione di componenti contenenti acido sialico è più elevata nel latte umano che negli alimenti per lattanti. Un effetto inibitorio di GMP su Bacteroides, clostridi ed E. in questo studio è stato osservato coli, tre organismi potenzialmente patogeni. Mentre nelle colture batch preliminari che utilizzano conteggi di materiale fecale adulto sono stati generalmente conservati, una tendenza al ribasso è stato visto in coltura continua. Tuttavia, una riduzione statisticamente significativa di questi organismi è stata rilevata solo in colture con materiale fecale di neonati di 6 mesi. Risultati simili sono stati osservati nel latte materno, che ha ridotto significativamente i clostridi e l’E. coli mentre i Bacteroides sono rimasti invariati. Al contrario, il mezzo basale ha aumentato significativamente i livelli di Bacteroides dimostrando che i cambiamenti nella composizione della flora non erano il risultato del lavaggio, ma dipendevano dal mezzo di fermentazione.

α-La, un componente regolatore della lattosio sintasi, condivide un alto livello di identità di sequenza ai lisozimi di tipo c e ha una struttura tridimensionale simile che suggerisce che provenivano da un gene ancestrale comune . Diversi studi sono stati condotti per suggerire che α-la potrebbe avere effetti simili sui patogeni . Al contrario, Pelligrini et al. ha scoperto che la digestione proteolitica da tripsina e pepsina ha prodotto tre peptidi con proprietà battericide, per lo più attivi contro gli organismi Gram-negativi. Le proprietà batteriostatiche dell’α-la idrolizzato sono state osservate specificamente per E. coli. In questo studio è stato osservato un effetto inibitorio di α-la su Bacteroides, clostridi ed E. coli. Ancora una volta, una riduzione statisticamente significativa di questi organismi è stata rilevata solo in colture che eseguono materiale fecale di neonati di 6 mesi, un risultato paragonabile a quello ottenuto per i controlli del latte materno.

Il nostro studio ha confermato che l’acetato era il principale SCFA nei neonati allattati al seno rispetto ai neonati allattati artificialmente, insieme a basse concentrazioni di propionato e ad una quasi totale assenza di butirrato nei primi 117 giorni di vita . Lattato e acetato generalmente si sono verificati in un rapporto 2:3, che conferma il ruolo predominante dei bifidobatteri nella microflora come descritto da Rasic e Kurmann . Un’alta incidenza di lattato è anche tipica della fermentazione incompleta o rapida comunemente associata a un pH acido come visto nei bambini allattati al seno . Tuttavia, questo non è stato confermato qui poiché l’inoculo fecale dei donatori allattati al seno che fermentano il latte materno ha prodotto un profilo acido quasi completamente privo di lattato. D’altra parte, i campioni fecali che fermentano la formula α-la – e GMP-integrata hanno prodotto un profilo acido caratteristico della fermentazione della formula con concentrazioni più elevate di n-butirrato, che aumentavano con l’età del donatore . Tuttavia, l’acetato è rimasto predominante come si è visto esclusivamente nei neonati allattati al seno.

In sintesi, abbiamo mostrato gli effetti microbiologici della supplementazione di formule per lattanti con α-la e GMP. Rispetto ai precedenti studi in vitro con colture pure di bifidobatteri, non è stato osservato un effetto bifidogenico dei due integratori utilizzando inocula fecale. Tuttavia, è stata osservata una riduzione statisticamente significativa della microflora potenzialmente patogena, simile a quella osservata nei neonati allattati al seno. Pertanto, in questo contesto, si può concludere che la supplementazione di α-la e GMP in combinazione con elevate quantità di acetato ha effetti benefici sulla microflora umana.

Ringraziamenti

I ricercatori desiderano ringraziare la signora Alethea Hill così come i donatori e i loro genitori per il loro sostegno, entusiasmo e aiuto prezioso per lo studio.

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