szakaszos tenyésztés és kétlépcsős folytonos tenyésztési rendszer alkalmazása a kiegészítő GmbH-laktalbumin és glikomakropeptid humán bélbaktériumok vegyes populációira gyakorolt hatásának tanulmányozására

absztrakt

bizonyos tejfaktorok elősegíthetik a gazdabarát gastrointestinalis mikroflóra növekedését. Ez megmagyarázhatja, hogy a szoptatott csecsemők miért tapasztalnak kevesebb bélfertőzést, mint a tápszerrel táplált társaik. A tápszer-kiegészítés hatását két ilyen tényezővel vizsgálták ebben a tanulmányban. Csecsemő székletmintákat használtunk a glikomakropeptiddel és a ons-laktalbuminnal kiegészített tápszerek fermentálására egy kétlépcsős összetett folytonos tenyésztési modellben. A bakteriológiát fluoreszcens in situ hibridizációval határoztuk meg. A bifidobaktériumok száma stabil volt, míg a laktobacillusok csak az anyatejjel rendelkező erekben emelkedtek szignifikánsan. A Bacteroides, clostridia és Escherichia coli minden esetben jelentősen csökkent. Az acetát volt a fő sav, amelyet nagy mennyiségű propionáttal és laktáttal együtt találtak. Az anyatej-helyettesítő tápszerek megfelelő tejfehérjékkel történő kiegészítése hasznos lehet az anyatej jótékony bakteriológiai hatásainak szimulálásában.

1 Bevezetés

az emberi vastagbél egy komplex ökoszisztéma, amely baktériumok széles skáláját rejti magában. Úgy gondolják, hogy egyszerre legalább 400 különböző baktériumfaj van jelen, g székletenként legfeljebb 1012 baktérium található . A mikroflórát születéskor szerzik be, a steril újszülöttet a szülés során különféle baktériumok gyarmatosítják . Az élet első néhány napján táplálkozási szempontból igénytelen prokarióták, például enterobaktériumok, staphylococcusok és streptococcusok (beleértve az enterococcusokat is) dominálnak. Az élet első hetében olyan nemzetségek jönnek létre, mint a bifidobaktériumok és a Bacteroides . Úgy gondolják, hogy a szoptatott csecsemőknek vastagbélflórájuk van, amelyet számszerűen a bifidobaktériumok uralnak, míg a tápszerrel tápláltaknak összetettebb mikrobiótájuk van, amelyek összetétele hasonló a felnőttekéhez . A bifidobaktériumok erőteljes antimikrobiális hatást fejthetnek ki számos bél kórokozóval szemben, mint például bizonyos Enterobacteriaceae és Clostridium spp. Mint ilyen, a bifidobaktériumok túlsúlyát a bél egészségének javulásának egyik mutatójának tekintik . A normál bél mikroflórára vonatkozó megfigyelések nagyrészt kvantitatív lemezkultúrából és fenotípusos jellemzésből származnak, amelyek korlátozottak a visszanyerési hatékonyság és a kezelő szubjektivitása szempontjából .

Továbbá, mivel a proximális vastagbél fizikailag nem érhető el rutin célokra, a fermentációval kapcsolatos mikrobiális vizsgálatok többségét bélsárral végezték baktériumok szakaszos tenyészetben vagy egylépcsős kemosztatikumok . A kötegelt tenyésztés lehetővé teszi a különféle szubsztrátok fermentálhatóságának meghatározását rövid időszakokban (24 óra). Ugyanakkor jelentős különbségek vannak a szubsztrát elérhetőségében és a környezeti feltételekben a proximális és a disztális vastagbél között, ami nem szimulálható egyetlen érrendszerben .

ezzel szemben az in vitro rendszerek, amelyek több fermentációs edényt használnak sorba rendezve, előnyösek, mivel képesek összetettebb környezeti feltételeket modellezni, miközben lehetővé teszik a térbeli és időbeli heterogenitást . Például egy kétlépcsős kemosztát, amelynek sejt-újrahasznosítása a másodiktól az első szakaszig kielégítő eredményeket hozott . A felnőtt emberi vastagbél modellezésének további finomítását Macfarlane et al. háromlépcsős összetett folyamatos tenyésztési rendszer használata. Ezt mikrobiológiailag validálták a boncolás során hirtelen halálos áldozatoktól kapott emberi vastagbél-anyaggal szemben. Az ilyen modellek értékesek a bél mikroflóra tanulmányozásához, mivel a különböző fizikai-kémiai körülmények szabályozhatók. Ennek egyértelmű gazdasági előnyei vannak, de különösen fontos az emberi tanulmányok tervezéséhez.

a bélsár flórájának különbségei tükröződnek a különböző Laktát -, rövid-(SCFA) és elágazó láncú zsírsavmintákban is, amelyek a bakteriális fermentáció közbenső és végtermékei . Termelési sebességüket és fermentációs mintázatukat a bélbaktérium flórájának szubsztrát-hozzáférhetősége is meghatározhatja . Ezért az étrend vagy az antimikrobiális terápia megváltozása a széklet flórájában megváltoztathatja a fermentációs mintákat és a szerves savkoncentrációt . Az ilyen savak mennyiségét embereken nehéz meghatározni, és csak néhány vizsgálatot végeztek, amelyek azt mutatják, hogy felnőtteknél naponta 300 mmol és 1-2 mol közötti sav keletkezik. Az acetátot minden esetben az elsődleges SCFA-nak találták, és a bizonyítékok arra utalnak, hogy a caecalis SCFA koncentrációja körülbelül kétszerese a recto-sigmoid területen .

két tejkomponensről korábban kimutatták, hogy gátolja a gastrointestinalis fertőzéseket és/vagy in vitro stimulálja a bifidobaktériumokat. A glikomakropeptidet (GMP), amely a CA-kazein egyik származéka, in vitro alaposan tanulmányozták, és kimutatták, hogy gátolja a baktériumok, vírusok és toxinok sejtmembránhoz való tapadását a kórokozó receptorhelyeihez való kötődés révén . Ezek az in vitro vizsgálatok azt is kimutatták, hogy a GMP erőteljesen elősegítette a Bifidobacterium breve, a B. bifidum, a B. infantis és a Lactococcus lactis növekedését. kimutatták, hogy a C-típusú lizozimokhoz hasonló tercier szerkezettel rendelkező CA-laktalbumin (Ca-La) hasonló hatásokkal rendelkezik . Pihlanto-Lepp (magyarul: Lepp) és társai. korábban azt mutatták, hogy a ons-la csökkentette az Escherichia coli jm103 metabolikus aktivitását a normál érték mindössze 21% – ára. Ezenkívül a tisztított tehéntej vizsgálata azt mutatta, hogy a B. infantis és a B. breve esetében a B. infantis hatékony növekedésserkentője volt a B. La.

ebben a tanulmányban kötegelt tenyésztést és egy kétlépcsős összetett folyamatos tenyésztési rendszert használtunk a fermentációs tulajdonságok és a bakteriális tevékenységek tesztelésére az anyatej-helyettesítő tápszerek kiegészítése után a GmbH-val és a GMP-vel. A folyamatos tenyésztési rendszert a Macfarlane által kifejlesztett háromlépcsős modellből adaptálták et al. . Kisebb működési volumene és gyorsabb forgalma megpróbálta figyelembe venni az emberi csecsemőknél talált fizikai tényezőket. Megvizsgáltuk, hogy a 6-la és a GMP kiegészítése megváltoztathatja-e a gasztrointesztinális flórát, hogy hasonló előnyökkel járjon, mint a szoptatott csecsemőknél.

2 Anyagok és módszerek

2.1 szakaszos tenyésztés

az anaerob szakaszos tenyésztési rendszerek esetében a bazális tenyésztési táptalaj (literenként): 1 g pepton, 1 g élesztőkivonat, 0,05 g NaCl, 0,02 g K2HPO4, 0,02 g KH2PO4, 0,005 g MgSO4·7h2o, 0,005 g CaCl2·6H2O, 1 g NaHCO3, 1 ml tween 80, 0.0025 g haemin, 5 db K1-vitamin, 0,25 g cisztein HCl és 0,25 g epesó 500 ml ionmentesített vízben oldva, 7,0 pH-ra állítva és autoklávozással sterilizálva. Az összes vegyszert a Sigma-ból (Poole, Dorset, Egyesült Királyság) nyerték, hacsak másként nem jelezzük. Steril táptalajt (50 ml) helyeztünk 100 ml-es tételes tenyészpalackokba, amelyek 0,5 g (1% m/v) vizsgálati készítményt (Arla Foods Ingredients, Viby, Denmark) tartalmaztak, vagy 68% m/v), vagy GMP-vel (80% m/v) kiegészítve, és oxigénmentes nitrogéngáz atmoszférában tartották. A képleteket összehasonlítottuk egy 1 tömegszázalék laktózt tartalmazó standarddal. Másnap friss székletmintát gyűjtöttek egy stomacher zsákban, és azonnal feldolgozták. A kísérletet ötször megismételtük öt különböző donor felhasználásával.

a kötegelt tenyészedényeket egészséges felnőtt önkéntesektől származó 5 ml 10%-os (m/v) székletürítéssel oltottuk be, amelyet anaerob foszfátpufferelt sóoldattal (PBS, 0,1 M, pH 7,2) készítettünk, és 1 ml-es mintákat vettünk 0-kor (a minta kötegelt tenyészetbe helyezése előtt), 6 órán át és 24 órán át, és további felhasználásig 4 ~ C hőmérsékleten tároltuk. A baktériumok fluoreszcens in situ hibridizációval (Fish) történő számlálásához az összegyűjtött minta 375 ml-es triplikátumát eltávolítottuk, és egy 1,5 ml-es Eppendorf-csőbe adtuk, amely 1125 ml szűrővel sterilizált, 4% (m/v) paraformaldehidet tartalmazott PBS-ben (pH 7,2), és legalább 4 órán át rögzítettük 4 CAC-on.a rögzített mintát ezután 5 percig centrifugáltuk 13 000 g-on, és a felülúszót eldobtuk. A pelletet 1 ml szűrt PBS-ben (pH 7,4) reszuszpendáltuk, amely 0,00001% (m/v) cetil-trimetil-ammónium-bromidot tartalmaz, és repellensáló Eppendorf-csőbe helyeztük (13 000 g, 5 perc). A pellet második mosása után a felülúszót eltávolítottuk, és a pelletet alaposan újraszuszpendáltuk 150 ~ ml szűrt PBS-ben és 150 ~ ~ 96% (v/v) etanolban. A mintát jól összekevertük, és -20 ft-on legalább 1 órán át tároltuk fluoreszcens szondával történő hibridizáció előtt (az alábbiakban leírtak szerint).

2.2 kétlépcsős folyamatos tenyésztési rendszer

a folyamatos tenyésztési rendszer két üvegedényből állt, V1 és V2, mindkettő 100 ml üzemi térfogattal. A hőmérséklet (37 oc) és a pH automatikusan szabályozásra került. A tenyészet pH-ja az edényekben 5 volt.2 a V1-ben, ami a proximális vastagbél alacsony pH-környezetét, 6,5 a V2-ben pedig a disztális vastagbél semlegesebb pH-ját jelzi. Mindegyik fermentort mágnesesen keverjük, és a tápközeget folyamatosan oxigénmentes nitrogénnel (15 ml min-1) sparráljuk, majd egy üveg közegtartályból perisztaltikus szivattyúval (Watson−Marlow, Falmouth, Egyesült Királyság) tápláljuk a V1-be. V1 egymás után szállított V2 keresztül egy túlfolyó és egy sor gátak. A v2 túlcsordulását egy hulladéktartályba vezették. A táptalaj a következőkből állt: (A) a fent leírt bazális táptalaj 1% (m/v) laktóz hozzáadásával (Sigma, Poole, Dorset, Egyesült Királyság), (B) humán anyatej (a Royal Berkshire Hospital, Reading, Egyesült Királyság szolgáltatta) 0,5 g l−1L-cisztein-HCl hozzáadásával, (C) 68% (m/v) kiegészítő (m/v) vizsgálati képlet, 1% (m/v) laktóz és 0,5 g l-1L−cisztein-HCl hozzáadásával, és (D) teszt formula 68% (W/V) GMP, 1% (W / V) laktóz és 0,5 g l-1L−cisztein-HCL. Az összes képletet az Arla Foods összetevőiből (Viby, Dánia) nyerték, és pepszin (575 e / g fehérje) alkalmazásával 2−es pH-n 2 órára (37 6.oc), majd pankreatin (50 E / g fehérje) és 0,5 g l-1 térfogatú epesav pH-n 6,5-re két órára (37 6. oc). Az anaerobicitás biztosítása érdekében a rezazurin 4 ml l−1 oldatát 250 mg L−1 törzsoldatból felforraljuk, és hozzáadjuk a táptalajhoz. A tápközeget ezután 80-20 percig hevítettük, egy éjszakán át szobahőmérsékletre hűtöttük, majd további 80-20 percig 80-2-ig hevítettük, mielőtt folyamatosan O2-mentes N2-vel szórtuk volna. A rendszert a hígítási sebesség reciprokaként kiszámított 12 órás retenciós idővel (R) üzemeltettük. A rendszer retenciós ideje az egyes fermentorok egyedi R értékeinek összege volt. Mindegyik fermentort 15 ml friss, 10% – os (m/v) fekáliás szuszpenzióval oltottuk be egészséges, 1-6 hónapos csecsemő donoroktól, és kiegészítő tápszerrel tápláltuk az anyatejjel. Az iszapot anaerob 0,1 M PBS (pH 7,2) alkalmazásával állítottuk elő. Minden kísérletet ötször megismételtünk különböző donorok alkalmazásával, kivéve a B csoportot (anyatej), ahol a kísérletet egyszer egy 3 hónapos, kizárólag szoptatott donor székletanyagának felhasználásával hajtották végre. A C és D csoportok mindegyike öt különböző személyt tartalmazott. A mintákat 1, 3 és 6 hónapos kor után vették, hogy felmérjék a széklet mikroflórájában mutatkozó különbségeket és a táplálékkiegészítők hatásosságában bekövetkező változásokat a csecsemők érése során. A fermentációs rendszert egy éjszakán át hagytuk egyensúlyba hozni, mielőtt a közepes szivattyút elindítottuk, és legalább 144 órán át működtettük az egyensúlyi állapot feltételeinek megteremtése érdekében. Az eredeti inokulumból (N) 3 ml-es mintákat vettünk egyensúlyi állapotban (T0) és egyensúlyi állapotban (TS) a fent leírt módon HALELEMZÉSRE előkészítettük.

2.3 baktériumok felsorolása halakon keresztül

oligonukleotid próbák (1.táblázat) a Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp./ Enterococcus, Bacteroides spp. , Clostridium histolyticum csoport és E. a coli-t az 5′ végén szintetizálták és monolacellálták Cy3-Mal (Ex 552 nm, Em 568 nm) Az Eurogentec (Abingdon, Egyesült Királyság) vagy az MWG-Biotech (Milton Keynes, Egyesült Királyság) által. A Bifidobacterium és Clostridium esetében egy éjszakán át 50, a Lactobacillus és Bacteroides esetében 45, Az E. coli esetében pedig 37, a C. A hibridizációhoz 200 db szűrt puffert (40 mM–es Tris−HCl pH 7,2, 1,8 M NaCl), amely 20 ml l-1 10% (m/v) SDS-t és 64 db HPLC minőségű vizet tartalmazott, 16 db fix cellához adtunk, és a megfelelő hőmérsékletre melegítettük. Előmelegített hibridizációs oldatot (90 ~ ~ l) adtunk a megfelelő szonda 10 ~ ~ l−jéhez (végső koncentráció 50 ng ~ ~ 1), majd az oldatot egy éjszakán át hibridizációs kemencében inkubáltuk. Az E. coli vizsgálathoz 264 (v/v)% formamidot tartalmazó hibridizációs puffert adtunk 16 (V / v) fix sejthez. A sejteket 5 ml mosópuffer (20 mM–es trisz-HCl pH 7,2, 0,9 M NaCl) hozzáadásával 5-100 MHz-es hibridizált mintához mostuk,20 6′, 6-diamidino-2-fenilindollal festettük (dapi, Ex 344, Em 450; 500 ng ml−1), és hibridizációs kemencében inkubáltuk 30 percig. A teljes számláláshoz 5-12 ml mintát vákuumban szűrtünk egy 0,2 ml pórusméretű polikarbonát szűrőre (Millipore, Watford, Egyesült Királyság), majd mikroszkóp tárgylemezre helyeztük. A szondák elhalványulásának elkerülése érdekében egy csepp SlowFade-Light Antifade Kit komponenst (Molecular Probes Europe, Leiden, Hollandia) adtunk a szűrőhöz. A diákat mikroszkóposan vizsgáltuk EPI-fluoreszcencia csatolással (Nikon UK, Kingston upon Thames, Egyesült Királyság). Az UV fényt használták a dapi-festett baktériumok számolására, a Cy3-festett sejteket pedig 550 nm-en számolták. Tizenöt véletlenszerű mezőt számoltunk meg a sejtek jó eloszlásával (10-100) minden szondára és mintára.

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

2.4 Volatile acid analysis

Undiluted aliquots (1.0 ml) mintát adagoltunk 1,5 ml-es Eppendorf csövekbe, és centrifugáltuk (13 000 g, 5 perc) pellet baktériumoknak és más szilárd anyagoknak. A felülúszót ezután 0,2-6 ml-es polikarbonát szűrővel szűrtük, majd belső standardként 4,3 mmol l−1 2-etil-vajsavat tartalmazó négy rész acetonitril-készítményhez adtuk. A kalibrálást standard ecetsav, propionsav, I-vajsav, n-vajsav, i-valerinsav, n-valerinsav, n-kapronsav és dl-tejsav oldatok alkalmazásával végeztük acetonitril. A zsírsavakat gáz–folyadék kromatográfiával határozták meg egy Agilent 6890 sorozatú GC rendszeren (Agilent, Waldbronn, Németország), amely Optima ffap oszloppal (25 m 0,32 mm, Macherey-Nagel, D ons, Németország) és lángionizációs detektorral volt felszerelve. A vivőgáz héliumát 1,8 ml min−1 áramlási sebességgel szállítottuk. Injektor, oszlop, valamint a detektor volt beállítva 220°C 140°C (isothermic), majd 220°C, ill. 5 perc elteltével az oszlop hőmérsékletét 240cc−ra növeltük 20ccc perc-1 lépésekben, hogy további 15 percig fusson. A csúcsokat egy Atlas Lab kezelő szoftvert futtató PC segítségével integrálták (Thermo Lab Systems, Mainz, Németország). A zsírsav-koncentrációkat úgy számították ki, hogy összehasonlították csúcsterületüket a belső standard értékeivel, és millimól / literben fejezték ki őket.

2,5 Statisztikai analízis

a statisztikai analízist egyirányú ANOVA (inokulum, versus steady-state, TS) alkalmazásával végeztük a szignifikancia meghatározásához P< 0,05, hacsak másként nem jelezzük.

3 eredmények

3.1 szakaszos tenyésztés

az oltás előtt a minták szinte azonos számú Bifidobacterium spp-t tartalmaztak., Bacteroides spp. és Clostridium spp. A laktobacillusok száma kevésbé volt. Az olyan kultúrákban, amelyek tartalmazzák a (D)-la-t (ábra). 1), az összszám, a bifidobaktériumok, a clostridia, a Lactobacillusok és a Bacteroides változatlanok maradtak. Az E. coli-szám szignifikánsan csökkent (P<0,01) 6 órás inkubáció után az 6-la kiegészítéssel, de ismét emelkedett a kiindulási szintre (nem látható).

1

átlagos baktériumszám (log10) felnőtt bélsár inokulumban és 1 tömegszázalék laktózt vagy 1 tömegszázalék laktózt tartalmazó bázisközeget tartalmazó kötegelt tenyészetekben. Az eredmények átlagok (log10 / g nedves tömeg) 6DN=széklet inokulum; 24 óra, laktóz=24 óra laktózt tartalmazó inkubáció után tenyésztés; 24 óra, a-la/GMP=24 óra inkubáció után tenyésztés, amely 64 óra alatt tartalmaz CAC-t, amely tartalmazza a CAC-t vagy a GMP-t.

1

átlagos baktériumszám (log10) felnőtt bélsár inokulumban és 1 tömegszázalék laktózt vagy 1 tömegszázalék laktózt tartalmazó bázisközeget tartalmazó kötegelt tenyészetekben. Az eredmények átlagok (log10 / g nedves tömeg) 6DN=széklet inokulum; 24 óra, laktóz=24 óra laktózt tartalmazó inkubáció után tenyésztés; 24 óra, a-la/GMP=24 óra inkubáció után tenyésztés, amely 64 óra alatt tartalmaz CAC-t, amely tartalmazza a CAC-t vagy a GMP-t.

GMP-t tartalmazó kultúrák (ábra. 1) a bifidobaktériumok, a Bacteroides, a Lactobacillusok és a clostridia általánosan fenntartott száma. Az E. coli száma jelentősen csökkent (p<0,05) 6 óra inkubáció után, de ismét bazális szintre emelkedett (nem látható).

3.2 kétlépcsős összetett folyamatos tenyésztési rendszer

ugyanazon standard táptalajt tartalmazó edényekben (1 tömegszázalék laktózt tartalmazó bazális táptalaj, ábra. 2), az összes baktériumszám, a bifidobaktériumok, a Lactobacillusok és a clostridia állandó maradt. Ezzel szemben a Bacteroides szignifikánsan növekedett mindkét fermentációs edényben az egyensúlyi állapot után, és mindkét edényben magasabb maradt, mint az inokulum szintje egyensúlyi állapotban (P<0,05). Statisztikailag szignifikáns csökkenés (p<0,05) figyelhető meg az E. coli esetében a 2.érben (pH 6,5) az egyensúlyi állapot után. Ez azonban nem maradt fenn, és mindkét ér egyensúlyi állapotban hasonló E. coli-szinttel rendelkezett, ami alacsonyabb volt, mint az inokulum.

2

átlagos baktériumszám (log10) az 1 tömegszázalék laktózt vagy anyatejet (BM) tartalmazó bazális táptalajjal rendelkező fekális inokulum és kontroll fermentor edényekben. Az eredmények középértékek (log10 / g nedves tömeg), S. D. n=széklet inokulum; V1TS = 1. edény egyensúlyi állapotban (pH 5,2); V2TS=2.edény egyensúlyi állapotban (pH 6,5).

2

Az átlagos baktériumszám (log10) a székletben lévő inokulum és kontroll fermentor edényekben, amelyek bazális táptalaja 1 tömegszázalék laktózt vagy anyatejet (BM) tartalmaz. Az eredmények középértékek (log10 / g nedves tömeg), S. D. n=széklet inokulum; V1TS = 1. edény egyensúlyi állapotban (pH 5,2); V2TS=2.edény egyensúlyi állapotban (pH 6,5).

az anyatejet tartalmazó edények után (ábra. 2) 24 órán át egyensúlyban hagyták, statisztikailag szignifikáns növekedést (P<0,05) figyeltek meg a laktobacillusok esetében a 2.érben (pH 6.5), amelyet az egyensúlyi állapot eléréséig megtartottak. A bifidobaktériumok száma stabil maradt. Ezzel szemben a clostridia szignifikánsan csökkent (p<0,01) mindkét erekben, és egyensúlyi állapotban teljesen eltűnt az 1.edényből (pH 5,2). Hasonló csökkenést (p<0,05) figyeltek meg az E. coli esetében az 1.érben (pH 5,2), de a 2. érben (pH 6,5) nem. Az 1 és 3 hónapos csecsemőkből nyert székletmintákkal beoltott, 6-la – t tartalmazó hajók összképe stabil volt, valamint más baktériumok szintje (nem látható). Amikor a fermentorokat 6 hónapos csecsemőkből nyert székletmintákkal oltottuk be (ábra. 3), az összszám és a laktobacillusok száma változatlan maradt. A Bacteroides, clostridia és E. coli száma észrevehetően csökkent az egyensúlyi állapot után, és statisztikailag szignifikáns csökkenést (p<0,05) figyeltek meg mindkét pH-értéknél. A GMP – t tartalmazó és 1 és 3 hónapos csecsemőkből származó székletmintákkal beoltott edények összképe, Bacteroides és E. coli volt, amelyek ingadoztak, de stabilak maradtak. Amint azt a ons-la esetében megfigyelték, a lactobacillusok enyhe emelkedő tendenciát mutattak a kezdeti mintákhoz képest, de statisztikai szignifikanciát nem figyeltek meg (nem látható). Amikor a fermentorokat 6 hónapos csecsemők székletével oltottuk be (ábra. 3), a teljes szám, a Lactobacillusok és a bifidobaktériumok változatlanok maradtak. A Bacteroides, clostridium és E. coli sejtszám észrevehetően csökkent az egyensúlyi állapot után, és statisztikailag szignifikáns csökkenést (P<0,05) figyeltek meg, hasonlóan ahhoz, amit az additivin-la-vel kiegészített képletnél tapasztaltak, mindkét pH-értéknél.

3

átlagos baktériumszám az inokulum és fermentor edényekben (log10), amelyek 6 hónapos donorok székletét tartalmazzák. Az eredmények középértékek (log10 / g nedves tömeg), S. D. n=széklet inokulum; V1TS = 1. edény egyensúlyi állapotban (pH 5,2); V2TS=2.edény egyensúlyi állapotban (pH 6,5).

3

átlagos baktériumszám az inokulum és fermentor edényekben (log10), amelyek 6 hónapos donorok székletét tartalmazzák. Az eredmények átlagok (log10 / g nedves tömeg) 6DN = széklet inokulum; V1TS = 1. edény egyensúlyi állapotban (pH 5,2); V2TS = 2. edény egyensúlyi állapotban (pH 6,5).

3,3 szerves sav

a szerves savak összmennyisége statisztikailag szignifikánsan változott (P<0,05) az inokula és a minta ideje között, az inokula átlagos összsavtartalma 4,28 mmol l−1, 8,16 mmol l−1 és 15,64 mmol l−1 volt, szemben a 73,80 mmol/l−1 értékekkel (tartomány 18, 93–160, 49), 39, 29 mmol l−1 (tartomány 15, 30–100, 28) és 80, 49 mmol l−1 (tartomány 28, 07–177, 34) az 1, 3 és 6 hónapos donorok esetében. Standard hibák voltak 4.96%, 3.10%, 2.61%, 1.80%, 0.91%, 0.84%, 1.91% és 5.12% acetát, propionát, i-butirát, n-butirát, i-valerát, n-valerát, kaproát és Laktát esetében. Az acetát volt a domináns sav minden csoportban (ábra. 4) Ezt követi a laktát és a propionát, átlagosan az összes sav 63% – át, 21% – át, 11% – át. a d(−)-Laktát túlnyomórészt az l(+)-laktáthoz képest található meg, amely csak szórványosan és minimális mennyiségben fordult elő. Nem találtak statisztikailag szignifikáns különbséget a vizsgálati csoportok között az izoacidok, a valerát és a kaproát tekintetében, amelyek nyomokban jelentkeztek.

4

a sav átlagos relatív mennyisége (%) a fermentor edényekben. Étrendek: N = inokulum; a-la (Ca)=Ca) – laktalbumin; GMP = glikomakropeptid; BM=anyatej. Donor kor: 1=1 hónap; 3=3 hónap; 6=6 hónappal a születés után.

4

a sav átlagos relatív mennyisége (%) a fermentor edényekben. Étrendek: N = inokulum; a-la (Ca)=Ca) – laktalbumin; GMP = glikomakropeptid; BM=anyatej. Donor kor: 1=1 hónap; 3=3 hónap; 6=6 hónappal a születés után.

volt azonban statisztikailag szignifikáns különbség (P< 0.05) A csoportok között a fő savak és az n-butirát relatív mennyiségére vonatkozóan. Az acetát és a laktát általában 3:2 arányban fordult elő, kivéve a 6 hónapos csecsemők inokulumát, ahol a laktát dominált (P<0,01). az n-butirát koncentrációja általában nőtt a donor életkorával, míg a propionát csökkent, amíg mindkettő koncentrációja körülbelül azonos volt. Kis mennyiségű I-butirátot is találtak minden donor korcsoportban, valamint az anyatej-csoportban.

4 megbeszélés

korábbi vizsgálatok alapján általában úgy gondolják, hogy a szoptatott csecsemők számára előnyös lehet A mikrobiota, amelyet számszerűen a bifidobaktériumok és/vagy a laktobacillusok dominálnak . korábban kimutatták, hogy a bifidobaktériumok kiválasztott tiszta tenyészeteit in vitro szignifikánsan stimulálják. Hasonló eredményeket azonban itt nem láttak a vegyes kultúrában. Felnőtt székletanyaggal beoltott előzetes tételkultúrákban nem figyeltek meg statisztikailag szignifikáns hatást a jótékony mikroflórára. Ugyanez volt igaz mindkét kiegészítőre, ha folyamatos tenyészetben használták, különféle korú csecsemők székletanyagával beoltva csoportok. Ennek ellenére a bifidobaktériumok voltak a domináns csoportok mind a tesztkészítményekben, mind az anyatej-szabályozásban, ahol a bifidobaktériumok szintén állandóak maradtak a kísérlet során. A laktobacillusok esetében mélyebb hatást tapasztaltak. Az anyatej jelentősen növelte a laktobacillusokat. A 3 hónapos csecsemők székletében a GMP-vel a laktobacillusok számának kismértékű, de statisztikailag jelentéktelen növekedését mutatták ki, ez a tendencia folytatódott a 6 hónapos csecsemők székletanyagának felhasználásával végzett kísérletekben.

úgy gondolják, hogy mindkét formula-kiegészítőnek van valamilyen gátló hatása a különféle kórokozókra. A GMP-ről korábban kimutatták, hogy számos anti-patogén tulajdonsággal rendelkezik mind az N-acetil-neuraminsavat (sziálsavat) tartalmazó szénhidrátláncban, mind a polipeptid részében . A sziálsavak jelenléte a bélsejtek felszínén gyakran szükséges a különböző bélben oldódó kórokozók fertőzéséhez, és a GMP exogén forrása gátolhatja a baktériumok tapadását, ami elengedhetetlen a fertőzéshez. Ezt Kawakami bizonyította azáltal, hogy gátolta az enteropatogén E. coli tapadását az emberi bélsejtvonalakhoz. Általában a sziálsavat tartalmazó komponensek koncentrációja magasabb az anyatejben, mint az anyatej-helyettesítő tápszerekben. A GMP gátló hatása a Bacteroides, clostridia és E. coli-t, három potenciálisan patogén organizmust figyeltek meg ebben a vizsgálatban. Míg az előzetes kötegelt tenyészetekben a felnőtt széklet anyagszámát általában konzerválták, a folyamatos tenyészetben csökkenő tendencia figyelhető meg. Ezeknek az organizmusoknak a statisztikailag szignifikáns csökkenését azonban csak 6 hónapos csecsemők székletanyagát tartalmazó tenyészetekben észlelték. Hasonló eredményeket figyeltek meg az anyatejben, amely jelentősen csökkentette a clostridia és az E. coli hatását, míg a Bacteroides változatlan maradt. Ezzel szemben a bazális közeg jelentősen megnövelte a Bacteroides szintjét, ami azt mutatja, hogy a flóra összetételének változása nem a kimosódás eredménye, hanem a fermentációs közegtől függ.

a laktóz-szintáz szabályozó komponense, a C-típusú lizozimokhoz hasonló szekvencia-azonossággal rendelkezik, és hasonló háromdimenziós szerkezettel rendelkezik, ami arra utal, hogy egy közös ősi génből származnak . Számos vizsgálatot végeztek arra utalni, hogy a 6-la hasonló hatással lehet a kórokozókra . Ellentétben, Pelligrini et al. megállapította, hogy a tripszin és a pepszin által végzett proteolitikus emésztés három baktericid tulajdonságú peptidet eredményezett, amelyek többnyire aktívak a Gram-negatív organizmusokkal szemben. Bakteriosztatikus a hidrolizált ons-la tulajdonságait kifejezetten az E. coli esetében figyelték meg. Ebben a vizsgálatban a bakteroidokra, a clostridiumokra és az E. coli-ra gyakorolt gátló hatást figyelték meg. Ezen organizmusok statisztikailag szignifikáns csökkenését csak a 6 hónapos csecsemők székletanyagát futtató tenyészetekben észlelték, ez az eredmény összehasonlítható az anyatej-kontrollok eredményével.

Vizsgálatunk megerősítette, hogy az acetát volt a fő SCFA a szoptatott csecsemőknél, összehasonlítva a palackban táplált csecsemőkkel, alacsony propionátkoncentrációval és a butirát szinte teljes hiányával az élet első 117 napjában . A laktát és az acetát általában 2:3 arányban fordult elő, ami megerősíti a bifidobaktériumok domináns szerepét a mikroflórában, amint azt Rasic és Kurmann leírta . A laktát magas előfordulása szintén jellemző a hiányos vagy gyors fermentációra, amely általában savas pH-val társul, amint az a szoptatott csecsemőknél megfigyelhető . Ezt azonban itt nem erősítették meg, mivel az anyatejet fermentáló szoptatott donorok széklet inokuluma savprofilt eredményezett, amely szinte teljesen mentes a laktáttól. Másrészről, a székletminták fermentálása során a fő-la-és a GMP-vel kiegészített tápszer a tápszer fermentációjára jellemző savprofilt eredményezett, magasabb n-butirát koncentrációval, amely a donor életkorával nőtt . Az acetát azonban továbbra is domináns maradt, amint azt kizárólag szoptatott csecsemőknél figyelték meg.

összefoglalva, megmutattuk az anyatej-helyettesítő tápszerek kiegészítésének mikrobiológiai hatásait a (Z) 6-la és a (Z) GMP kombinációval. A bifidobaktériumok tiszta tenyészeteit alkalmazó korábbi in vitro vizsgálatokhoz képest a két kiegészítés bifidogén hatását nem figyelték meg székletoltással. Ugyanakkor a potenciálisan patogén mikroflóra statisztikailag szignifikáns csökkenését figyelték meg, amely hasonló volt a szoptatott csecsemőknél megfigyelthez. Így ebben az összefüggésben azt a következtetést lehet levonni, hogy a nagy mennyiségű acetáttal kombinációban alkalmazott addicionális és GMP kiegészítés jótékony hatással van az emberi mikroflórára.

Köszönetnyilvánítás

a kutatók szeretnék megköszönni Alethea Hill asszonynak, valamint az adományozóknak és szüleiknek a támogatást, lelkesedést és felbecsülhetetlen segítséget a tanulmányhoz.

Borriello
S. P.

(

1986

)

a gyomor-bél traktus mikrobiális flórája

. In:

mikrobiális anyagcsere az emésztőrendszerben

(

Hill
M. J.

, Szerk.), pp.

2

16

.

CRC nyomja meg

,

Boca Raton, FL

.

a Sonnenborn-tól
U.

stobernack
H.-P.

Proppert
Y.

(

1990

)

az anaerob bélflóra kialakulása újszülöttekben

.

haladás. Med.
108

,

420

424

.

Mitsuoka
T.

(

1995

)

összehasonlító bél mikrobiális ökológia és anyagcsere emberben és állatokban

. In:

az anaerobok orvosi és fogászati vonatkozásai

(

Duerden
B. I.

Wade
W. G.

Brazier
J. S.

Eley
A.

Wren
B.

Hudson
M. J

, Szerk.), pp.

87

107

.

tudományos vélemények

.

Harmsen
H. J. M.

Wildeboer-Veloo
A. C. M.

Raangs
div > G. C.

et al. (

2000

)

a bélflóra fejlődésének elemzése szoptatott és tápszerrel táplált csecsemőknél molekuláris azonosítási és kimutatási módszerekkel

.

J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr.
30

,

61

67

.

Salminen
S.
Bouley
C.
Boutron-Ruault
M.-C.

et al. (

1998

)

funkcionális élelmiszer-tudomány és gasztrointesztinális fiziológia és funkció

.

Br. J. Nutr.
80

,

S147

S171

.

Harmsen
H. J. M.

Gibson
G. R.

et al. (

1999

)

működőképes sejtszám és fluoreszcencia in situ hibridizáció összehasonlítása specifikus rRNS-alapú próbákkal az emberi széklet baktériumok számszerűsítésére

.

FEMS Microbiol. Lett.
183

,

125

129

.

Macfarlane
G. T.

Gibson
G. R.

MacFarlane
S.

(

1994

)

rövid láncú zsírsav-és laktáttermelés emberi bélbaktériumok által szakaszos és folyamatos tenyésztésben

. Ban ben:

rövid láncú zsírsavak

(

kötőanyag
H. J.

Cummings
J. H.

Soergel
K. H.

, Szerk.), pp.

44

60

.

Kluwer Publishing

,

London

.

Allison
C.

mcfarlan

.

Macfarlane
G. T.

(

1989

)

vizsgálatok az egy-és többlépcsős folyamatos tenyésztési rendszerekben termesztett emberi bélbaktériumok vegyes populációin

.

Appl. Kb. Mikrobiol.
55

,

679

683

.

Marsh
P.

(

1995

)

a folyamatos tenyésztés szerepe az emberi mikroflóra modellezésében

.

J. Chem. Technikus. Biotechnol.
64

,

1

9

.

Veilleux
B. G.

Rowland
I.

(

1981

)

a patkány bélrendszerének szimulációja ökoszisztéma kétlépcsős folyamatos tenyésztési rendszert használva

.

J. Gen. Microbiol.
123

,

103

115

.

Macfarlane
G. T.

Macfarlane
S.

Gibson
G. R.

(

1998

)

háromlépcsős összetett folyamatos tenyésztési rendszer validálása a retenciós időnek az emberi vastagbélben lévő baktériumok ökológiájára és anyagcseréjére gyakorolt hatásának vizsgálatára

.

Microb. Ecol.
35

,

180

187

.

Edwards
C. A.

Parrett
A. M.

Balmer
S. E.

Wharton
B. A.

(

1994

)

széklet rövid láncú zsírsavak szoptatott és tápszerrel táplált csecsemőknél

.

Acta Paediatr.
83

,

459

462

.

Cummings
J. H.

(

1983

)

erjedés az emberi vastagbélben: bizonyítékok és következmények az egészségre

.

Lancet
1

,

1206

1208

.

midtvedt
T.

carlstedt-Duke

.

H .. Versstad
T.

et al. (

1986

)

a perorális antimikrobiális szerek hatása a bél mikroflóra biotranszformációs aktivitására egészséges alanyban

.

Eur. J. Blink. Fektessen be.
16

,

11

17

.

Kawakami
H.

(

1997

)

Biological significance of sialic acid-containing substances in milk and their application

.

Recent Res. Dev. Agric. Biol. Chem.
1

,

193

207

.

Idota
T.

Kawakami
H.

Nakajima
I.

(

1994

)

Growth-promoting effects of N-actelylneuraminic acid containing substances on bifidobacteria

.

Biosci. Biotechnol. Biochem.
58

,

1720

1722

.

Bouhallab
S.

Favrot
C.

maubois
J. L.

(

1993

)

a kazeinomakropeptid triptikus emésztésének növekedést elősegítő aktivitása a Lactococcus lactis ssp számára. lactis

.

tej
73

,

73

77

.

Xue
Y.

Lui
J. N.

Sun
Z.

Matt
Z.
Wu

.

Zhu
D.

(

2001

)

ca lizozimként ható laktalbumin mutáns

.

Proteins Struct. Funct. Genet.
42

,

17

22

.

Pihlanto-Lapp (Lapp)!!!!!!
Marnila
P.
Hubert
L.

rokka
T.

Korhonen
H. J. T.

Carpal
M.

(

1999

)

a tényezők hatása a Escherichia coli jm103

.

J. Appl. Mikrobiol.
87

,

540

545

.

Petschow
B. W.

Talbott
D.

(

1991

)

válasz Bifidobacterium fajok növekedésserkentők humán és tehéntejben

.

Pediatr. Res.
29

,

208

213

.

Frank
A. H.

Harmsen
H. J. M.

Raangs
G. C.

et al. (

1998

)

a baktériumpopulációk variációi az emberi székletben fluoreszcens in situ hibridizációval mérve csoportspecifikus 16S rRNS-célzott oligonukleotid próbákkal

.

Appl. Kb. Mikrobiol.
64

,

3336

3345

.

Neeser
J. R.

golliard
M.

woltz
A.

rouvet
M.

Dillmann
M. L.

Guggenheim
B.

(

1994

)

az orális bakteriális tapadás vitro modulátora nyállal bevont hidroxipatit gyöngyökhöz tejkazein-származékok által

.

orális Mikrobiol. Immunol.
9

,

193

201

.

Wold
A. E.

Adlerberth
I.

(

2000

)

a csecsemő bél mikroflórája-a fertőző betegségek elleni védelem következményei

. In:

a szoptatás Rövid és hosszú távú hatásai a gyermek egészségére

(

Keletzo
B.

et al. , Szerk.).

Kluwer Academic / Plenum Publishers

,

New York

.

pelligrini
A.

Thomas
U.
bramaz
N.

Hunziker
P.
von Fellenberg
R.

(

1999

)

három baktericid domén izolálása és azonosítása az encephalopathia alfa-laktalbumin molekulában

.

Biochim. Biophys. Acta
1426

,

439

448

.

Siigur
U.

Ormission
A.

Tamm
A.

(

1993

)

széklet rövid láncú zsírsavak szoptatott és palackban táplált csecsemőkben

.

Acta Paediatr.
82

,

536

538

.

Wolin
M. J.

Yerry
S.
Miller
T. L.
Zhang
Y.
Bank
S.

(

1998

)

változások az etanol, savak és H2 termelésében glükózból a 16-158 napos szoptatott csecsemő székletflórája által

.

J. Nutr.
128

,

85

90

.

Rasic
J. L.

Kurmann
J. A.

(

1983

)

bifidobaktériumok és szerepe

.

Birkhauser Verlag

,

Basel

.

Tianan
J.

Savaiano
D. A.

(

1997

)

a vastagbél fermentációjának szerkesztése bifidobaktériumok és pH in vitro

.

Dig. Tíz. Sci.
42

,

2370

2377

.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.