eräviljelyn ja kaksivaiheisen jatkuvan viljelyn käyttö täydentävän α-laktalbumiinin ja glykomakropeptidin vaikutuksen tutkimiseen ihmisen suolistobakteerien sekapopulaatioihin

Abstrakti

tietyt maitotekijät voivat edistää isäntäystävällisen ruoansulatuskanavan mikrobiston kasvua. Tämä saattaa selittää sen, miksi rintaruokinnassa olevilla lapsilla esiintyy vähemmän suolistotulehduksia kuin äidinmaidonkorviketta saaneilla. Tässä tutkimuksessa tutkittiin kaavan täydentämisen vaikutusta kahdella tällaisella tekijällä. Imeväisten ulostenäytteitä käytettiin glykomakropeptidillä ja α-laktalbumiinilla täydennettyjen formulaatioiden käymiseen kaksivaiheisessa yhdistemallissa. Bakteriologia määritettiin fluoresenssi in situ-hybridisaatiolla. Astioissa, jotka sisälsivät rintamaitoa sekä α-laktalbumiinia ja glykomakropeptidia, oli vakaat bifidobakteerien määrät, kun taas laktobasillien määrä lisääntyi merkittävästi vain rintamaitoa sisältäneissä astioissa. Bacteroides, clostridia ja Escherichia coli vähenivät merkittävästi kaikissa ajoissa. Asetaatti oli pääasiallinen löydetty happo yhdessä suurten propionaatti – ja laktaattimäärien kanssa. Äidinmaidonkorvikkeiden täydentäminen sopivilla maitoproteiineilla voi olla hyödyllistä rintamaidon hyödyllisten bakteriologisten vaikutusten simuloinnissa.

1 Introduction

ihmisen paksusuoli on monimutkainen ekosysteemi, jossa on laaja kirjo bakteereja. Vähintään 400 eri bakteerilajin arvellaan esiintyvän kerralla, ja uloste grammaa kohti bakteereita on jopa 1012 . Mikrobisto hankitaan syntyessään, jolloin steriili vastasyntynyt kolonisoituu erilaisten bakteerien vaikutuksesta synnytyksen aikana . Ensimmäisinä elinpäivinään ravinnollisesti vaatimattomat prokaryootit, kuten enterobakteerit, stafylokokit ja streptokokit (myös enterokokit), ovat vallitsevia. Ensimmäisen elinviikon aikana vakiintuvat suvut kuten bifidobakteerit ja Bacteroides . On ajateltu, että rintaruokituilla lapsilla on paksusuolen kasvisto, jota bifidobakteerit hallitsevat numeerisesti, kun taas äidinmaidonkorvikkeen saaneilla on monimutkaisempia mikrobeja, jotka ovat koostumukseltaan samanlaisia kuin aikuisilla . Bifidobakteereilla voi olla voimakkaita antimikrobisia vaikutuksia useisiin suolistopatogeeneihin, kuten tiettyihin enterobakteereihin ja Clostridium spp: hen. Sinällään bifidobakteerien hallitsevuutta pidetään yhtenä indikaattorina parantuneesta suoliston terveydestä . Suoliston normaalia mikrobistoa koskevat havainnot on suurelta osin saatu kvantitatiivisesta levyviljelmästä ja fenotyyppisestä karakterisoinnista, joilla on rajoituksensa talteenoton tehokkuudessa ja käyttäjän subjektiivisuudessa .

lisäksi, koska proksimaalinen paksusuoli on fyysisesti saavuttamattomissa rutiinitarkoituksiin, suurin osa käymistutkimuksista on tehty ulosteperäisillä bakteereilla joko eräviljelyssä tai yksivaiheisissa kemostaateissa . Eräviljely mahdollistaa erilaisten substraattien fermentoituvuuden määrittämisen lyhyissä jaksoissa (24 h). Proksimaalisen ja distaalisen paksusuolen substraatin käytettävyydessä ja ympäristöolosuhteissa on kuitenkin huomattavia eroja, joita ei voida simuloida yhdessä astiasysteemissä .

sen sijaan in vitro-järjestelmillä, joissa käytetään useita käymisastioita, jotka ovat linjassa sarjoissa, on etuja, koska ne pystyvät mallintamaan monimutkaisempia ympäristöolosuhteita samalla kun ne mahdollistavat spatiaalisen ja ajallisen heterogeenisuuden . Esimerkiksi kaksivaiheinen kemostaatti, jonka solujen kierrätys toisesta vaiheesta ensimmäiseen vaiheeseen, tuotti tyydyttäviä tuloksia . MacFarlane et al. käytetään kolmivaiheista yhdisteviljelmää. Tämä oli mikrobiologisesti validoitu ihmisen suolihuuhtelumateriaalilla, joka saatiin ruumiinavauksessa äkkikuoleman saaneilta. Tällaiset mallit ovat arvokkaita suoliston mikrobiston tutkimisessa, koska erilaisia fysikaalis-kemiallisia olosuhteita voidaan hallita. Tällä on selviä taloudellisia etuja, mutta se on erityisen tärkeää ihmistutkimusten suunnittelussa.

erot ulostekasvistossa näkyvät myös vaihtelevina laktaatti -, lyhyt-(SCFA) ja haaraketjuisina rasvahappoina, jotka ovat bakteerikäymisen väli-ja lopputuotteita . Niiden tuotantonopeus ja käymistapa voidaan määrittää myös suoliston bakteerikannan substraatin saatavuuden perusteella . Sen vuoksi ulosteen kasviston muutokset, jotka johtuvat ruokavalion muutoksesta tai mikrobilääkityksestä, voivat myös muuttaa käymistapoja ja orgaanisten happojen pitoisuutta . Tällaisten ihmisten tuottamien happojen määrää on vaikea määrittää, ja on tehty vain pieni määrä tutkimuksia, joiden mukaan aikuisilla tuotetaan päivittäin 300 mmol-1-2 mol happoa. Asetaatin todettiin olevan pääasiallinen tuotettu SCFA kaikissa tapauksissa, ja todisteet viittaavat siihen, että umpisuolen SCFA-pitoisuudet ovat noin kaksinkertaiset verrattuna recto-sigmoid-alueen pitoisuuksiin .

kahden maitokomponentin on aiemmin osoitettu estävän ruoansulatuskanavan infektioita ja / tai stimuloivan bifidobakteereja in vitro. Glykomakropeptidia (GMP), κ-kaseiinin johdannaista, on tutkittu laajasti in vitro ja sen on osoitettu estävän bakteerien, virusten ja toksiinien kiinnittymistä solukalvoon sitoutumalla taudinaiheuttajan reseptoripaikkoihin . Nämä in vitro-määritykset osoittivat myös, että GMP edisti voimakkaasti Bifidobacterium breven, B. bifidumin, B. infantisin ja Lactococcus lactisin kasvua. α-Laktalbumiinilla (α-la), jonka tertiäärinen rakenne on verrattavissa c-tyypin lysotsyymeihin, on osoitettu olevan samanlaisia vaikutuksia . Pihlanto-Leppälä ym. aiemmin osoitti, että α-la alensi Escherichia coli JM103: n metabolisen aktiivisuuden vain 21%: iin normaalista. Lisäksi puhdistetun lehmänmaidon testaus osoitti, että α-la oli B. infantisin ja B. breven voimakas kasvun edistäjä.

tässä tutkimuksessa käytimme eräviljelyä ja kaksivaiheista yhdisteviljelyjärjestelmää testataksemme käymisominaisuuksia ja bakteeritoimintaa α-la-ja GMP-äidinmaidonkorvikerehujen lisäyksen jälkeen. Jatkuvan viljelyn järjestelmä mukailtiin MacFarlane et al: n kehittämästä kolmivaiheisesta mallista. . Sen pienempi käyttövolyymi ja nopeampi vaihtuvuus yrittivät selittää ihmislapsilta löydetyt fyysiset tekijät. Testasimme, voiko α-la: n ja GMP: n lisääminen muuttaa ruuansulatuskanavan kasvistoa siten, että siitä on samanlaista hyötyä kuin rintaruokinnassa olevilla lapsilla.

2 materiaalia ja menetelmää

2, 1 Eräviljely

anaerobisissa eräviljelyjärjestelmissä pohjaviljelyaine, joka sisältää (per litra): 1 g peptonia, 1 g hiivauutetta, 0, 05 g NaCl, 0, 02 g K2HPO4, 0, 02 g KH2PO4, 0, 005 g MgSO4·7H2O, 0, 005 g CaCl2·6H2O, 1 g NaHCO3, 1 ml tween 80, 0.0025 g hemiiniä, 5 µl K1-vitamiinia, 0, 25 g kysteiini HCl: ää ja 0, 25 g sappisuoloja liuotettuna 500 ml: aan deionisoitua vettä, säädettynä pH: ksi 7, 0 ja steriloituna autoklavoimalla. Kaikki kemikaalit on saatu Sigmasta (Poole, Dorset, UK), ellei toisin mainita. Steriili väliaine (50 ml) laitettiin 100 ml: n eräviljelypulloihin, joissa oli 0, 5 g (1% w/v) testikaavaa (Arla Foods Ingredients, Viby, Tanska) täydennettynä joko α-la: lla (68% w/v) tai GMP: llä (80% w/v) ja säilytettiin hapettomassa typpikaasussa. Kaavoja verrattiin standardiin, joka sisältää 1% (w/w) laktoosia. Seuraavana päivänä tuore ulostenäyte kerättiin stomacher-pussiin ja käsiteltiin välittömästi. Koe toistettiin viisi kertaa käyttäen viittä eri luovuttajaa.

eräviljelyastioihin inokuloitiin 5 ml terveiltä aikuisilta vapaaehtoisilta 10-prosenttista (w / v) ulostelietettä, joka oli valmistettu anaerobisella fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS, 0, 1 M, pH 7, 2), ja 1 ml: n näytteet otettiin aikoina 0 (ennen näytteen sijoittamista eräviljelyyn), 6 tuntia ja 24 tuntia ja varastoitiin 4°C: ssa seuraavaan käyttöön saakka. Bakteerien laskemiseksi fluoresoivalla in situ-hybridisaatiolla (FISH) kerätystä näytteestä poistettiin 375-µl kolmikertaa ja lisättiin 1, 5 ml: n Eppendorf-putkeen, joka sisälsi 1125 µl suodatinsteriloitua 4-prosenttista (w/v) paraformaldehydiä PBS: ssä (pH 7.2) ja joka kiinnitettiin vähintään 4 tunnin ajan 4°C: ssa.kiinteää näytettä sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 13 000×g: n lämpötilassa ja supernatantti heitettiin pois. Pelletti suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan suodatettua PBS: ää (pH 7.4), joka sisälsi 0, 00001% (w/v) setyylitrimetyyliammoniumbromidia, ja siirrettiin Eppendorf-putkeen karkottamista varten (13 000×g, 5 min). Kun sakka oli pesty toisen kerran, supernatantti poistettiin ja sakka suspendoitiin perusteellisesti uudelleen 150 µl suodatettua PBS: ää ja 150 µl 96-prosenttista (v/v) etanolia. Näyte sekoitettiin hyvin, ja sitä säilytettiin -20°C: ssa vähintään 1 tunnin ajan ennen hybridisaatiota loistelampulla (jäljempänä kuvatulla tavalla).

2.2 kaksivaiheinen jatkuvaviljelyjärjestelmä

jatkuvaviljelyjärjestelmä koostui kahdesta lasiastiasta, V1: stä ja V2: sta, joiden molempien käyttötilavuus oli 100 ml. Lämpötila (37°C) ja pH säädettiin automaattisesti. Kulttuurin pH astioissa oli 5.2 v1: ssä, joka edustaa proksimaalisen paksusuolen alhaista pH-ympäristöä ja 6,5 v2: ssa, mikä osoittaa neutraalimpaa pH: ta distaalisessa paksusuolessa. Jokainen fermentori sekoitettiin magneettisesti ja kasvualusta sparrattiin jatkuvasti hapettomalla typellä (15 ml min-1) ja syötettiin lasisesta väliainesäiliöstä peristalttisella pumpulla (Watson−Marlow, Falmouth, UK) V1: een. V1 toimittaa V2: n juoksevasti ylivuodon ja sarjan sulkuputkien kautta. V2: n ylivuoto johdettiin jäteastiaan. Viljelyaine koostui a) edellä kuvatusta pohjaviljelyaineesta, johon oli lisätty 1% (w/v) laktoosia (Sigma, Poole, Dorset, UK), B) äidinmaidosta (Royal Berkshire Hospital, Reading, UK), johon oli lisätty 0, 5 g l−1l-kysteiini-HCl: ää), C) testikaava, jossa oli 68% (w/v) α-la: ta, 1% (w/v) laktoosia ja 0, 5 g l−1l-kysteiini-HCl: ää, ja D) testikaava, jossa oli 68% (w/v) l−1L-kysteiini-HCl: ää). w/v) GMP, 1% (w / v) laktoosia ja 0, 5 g l-1l-kysteiini-HCL: ää. Kaikki kaavat saatiin Arla Foods Ingredients-valmisteesta (Viby, Tanska), Ja ne testattiin pepsiinillä (575 U / g proteiinia) PH 2: ssa 2 tunnin ajan (37°C), minkä jälkeen annettiin pankreatiinia (50 U / g proteiinia) ja 0, 5 g l−1 tilavuusprosenttia sappihappoa PH 6, 5 kahden tunnin ajan (37°C). Anaerobisuuden varmistamiseksi keitettiin 4 ml l−1 resatsuriinin 250 mg l-1-Kantaliuosta ja lisättiin väliaineeseen. Väliainetta kuumennettiin 80°C: seen 20 minuutin ajan, jäähdytettiin huoneenlämpöön yön yli ja kuumennettiin 80°C: seen vielä 20 minuutin ajan, ennen kuin sitä jatkuvasti sparrattiin O2-vapaalla N2: lla. Järjestelmää käytettiin 12 tunnin retentioajalla (R) laskettuna laimennussuhteen käänteisarvona. Järjestelmän retentioaika oli kunkin fermentorin yksittäisten R-arvojen summa. Kuhunkin fermentoriin inokuloitiin 15 ml tuoretta 10-prosenttista (w/v) ulostelietettä terveiltä 1-6 kuukauden ikäisiltä luovuttajilta, ja sille syötettiin äidinmaitoa täydentävällä valmisteella. Liete valmistettiin anaerobisella 0,1 M PBS: llä (pH 7,2). Kaikki kokeet toistettiin viisi kertaa eri luovuttajilla, lukuun ottamatta ryhmää B (rintamaito), jossa koe tehtiin kerran käyttämällä 3 kuukauden ikäisen, yksinomaan rintaruokinnassa olleen luovuttajan ulostemateriaalia. Ryhmissä C ja D oli kussakin viisi eri yksilöä. Näytteet otettiin 1, 3 ja 6 kuukauden iässä, jotta voitiin arvioida mahdolliset erot ulosteen mikrobistossa ja mahdolliset muutokset lisäravinteiden tehossa imeväisten kypsyessä. Käymisjärjestelmän annettiin tasapainottua yön yli ennen keskipumpun käynnistämistä, ja sitä käytettiin vähintään 144 tunnin ajan vakaan tilan saavuttamiseksi. Alkuperäisestä inokulaatista (N) otettiin 3 ml näytteitä tasapainotuksen jälkeen (T0) ja vakaassa tilassa (TS), ja ne valmistettiin kala-analyysia varten edellä kuvatulla tavalla.

2,3 bakteerien määritys kalojen kautta

Oligonukleotidikoettimet (Taulukko 1) Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp./ Enterococcus, Bacteroides spp. , Clostridium histolyticum group ja E. joko Eurogentec (Abingdon, Yhdistynyt kuningaskunta) tai MWG-Biotech (Milton Keynes, Yhdistynyt kuningaskunta) syntetisoi coli-bakteerin ja merkkasi sen 5′: n päästä sy3: lla (Ex 552 nm, Em 568 nm). Hybridisaatio tehtiin yön yli bifidobakteerien ja Clostridiumin osalta 50°C: ssa, Lactobacillus-ja Bacteroides-bakteerien osalta 45°C: ssa ja E. coli-bakteerien osalta 37°C: ssa. Hybridisaatiota varten 16 µl kiinteisiin kennoihin lisättiin 200 µl suodatettua puskuria (40 mM Tris–HCl pH 7,2, 1,8 M NaCl), joka sisälsi 20 ml 10%: n (w/v) SDS: ää l−1 ja 64 µl HPLC-laatuista vettä ja lämmitettiin sopivaan lämpötilaan. Esikäsitelty hybridisaatioliuos (90 µl) lisättiin 10 µl: aan sopivaa anturia (lopullinen pitoisuus 50 ng µl−1) ja liuosta inkuboitiin yön yli hybridisaatiouunissa. E. coli-koetta varten 16 µl kiinteisiin soluihin lisättiin 264 µl hybridisaatiopuskuria, joka sisältää 35% (v/v) formamidia. Solut pestiin lisäämällä 5 ml pesupuskuria (20 mM Tris–HCl pH 7,2, 0,9 M NaCl) 5-100 µl hybridoitua näytettä, värjättiin 20 µl 4′,6-diamidino-2-fenyyliindolilla (Dapi, Ex 344, Em 450; 500 ng ml−1) ja inkuboitiin hybridisaatiouunissa 30 minuutin ajan. Kokonaislukujen osalta 5-12 µl näytettä vakuumisuodatettiin 0,2 µm: n huokoskokoiseen polykarbonaattisuodattimeen (Millipore, Watford, UK) ja asetettiin mikroskooppilevylle. Antureiden haalistumisen välttämiseksi suodattimeen lisättiin yksi pisara SlowFade-Light Antifade Kit-komponenttia A (Molecular Probes Europe, Leiden, Alankomaat). Dioja tutkittiin mikroskooppisesti EPI-fluoresenssiliittimellä (Nikon UK, Kingston upon Thames, UK). UV-valoa käytettiin DAPI-värjättyjen bakteerien laskemiseen ja sy3-värjättyjä soluja laskettiin 550 nm: ssä. Kullekin koettimelle ja näytteelle laskettiin viisitoista satunnaiskenttää, joiden solujakauma oli hyvä (10-100).

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

2.4 Volatile acid analysis

Undiluted aliquots (1.0 ml) näytettä annosteltiin 1, 5 ml: n Eppendorf-putkiin ja sentrifugoitiin (13 000×g, 5 min) bakteerien ja muiden kiinteiden aineiden pelleteiksi. Supernatantti suodatettiin 0,2-µm polykarbonaattisuodattimella ja lisättiin neljään osaan asetonitriiliä, joka sisälsi 4,3 mmol l−1 2-etyylivoihappoa sisäisenä standardina. Kalibroinnissa käytettiin etikkahapon, propionihapon, i-voihapon, n-voihapon, i-valeriaanahapon, n-valeriaanahapon, n-kapronihapon ja dl-maitohapon standardiliuoksia asetonitriilissä. Rasvahapot määritettiin kaasu-nestekromatografialla Agilent 6890-sarjan GC-järjestelmällä (Agilent, Waldbronn, Saksa), jossa oli Optima FFAP-kolonni (25 m×0,32 mm, Macherey-Nagel, Düren, Saksa) ja liekki-ionisaatiodetektori. Kantokaasu heliumia toimitettiin virtausnopeudella 1,8 ml min-1. Injektori, kolonni ja detektori asetettiin 220°C: n, 140°C: n (isoterminen) ja 220°C: n lämpötilaan. Kolonnin lämpötila nostettiin 5 minuutin kuluttua 240°C: seen 20°c min−1 askelin, jotta se kestäisi vielä 15 minuuttia. Peaks integroitiin Atlas Lab-hallintaohjelmistoa käyttävällä PC: llä (Thermo Lab Systems, Mainz, Saksa). Rasvahappojen pitoisuudet laskettiin vertaamalla niiden huippualueita sisäisen standardin vastaaviin ja ne ilmaistiin millimooleina litrassa.

2, 5 tilastollinen analyysi

tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen yksisuuntaista ANOVAA (inokulaatti, vs. steady-state, TS) merkitsevyyden määrittämiseksi p<0, 05, ellei toisin mainittu.

3 tulokset

3.1 Eräviljelmä

ennen inokulointia näytteissä oli lähes identtinen määrä Bifidobacterium spp., Bacteroides spp., ja Clostridium spp. Laktobasilleja oli vähemmän. Α-la: ta sisältävissä viljelmissä (Kuva. 1), kokonaislukumäärät, bifidobakteerit, clostridia, laktobasillit ja Bacteroides pysyivät muuttumattomina. E. coli-bakteerien määrä väheni merkitsevästi (p<0, 01) α-la-lisäyksen myötä 6 tunnin inkubaation jälkeen, mutta nousi jälleen lähtötasolle (ei näy).

1

keskimääräiset bakteerimäärät (log10) aikuisten siirrosaineen ulosteessa ja eräviljelmissä, jotka sisältävät pohjaviljelyä, jossa on 1% (w/w) laktoosia) tai 1% (w / w) testikaavaa. Tulokset ovat keskiarvoja (log10/g märkäpainoa)±S. D. n=inokulaatti ulosteessa; 24 h, laktoosi=viljelmä 24 tunnin inkubaation jälkeen, joka sisältää laktoosia; 24 h, a-la / GMP=viljelmä 24 tunnin inkubaation jälkeen, joka sisältää α-la: ta tai GMP: tä.

1

keskimääräiset bakteerimäärät (log10) aikuisten ulosteen siirrosaineissa ja eräviljelmissä, jotka sisältävät pohjaviljelyä, jossa on 1% (w/w) laktoosia) tai 1% (w / w) testikaavaa. Tulokset ovat keskiarvoja (log10/g märkäpainoa)±S. D. n=inokulaatti ulosteessa; 24 h, laktoosi=viljelmä 24 tunnin inkubaation jälkeen, joka sisältää laktoosia; 24 h, a-la / GMP=viljelmä 24 tunnin inkubaation jälkeen, joka sisältää α-la: ta tai GMP: tä.

GMP: tä sisältävät viljelmät (Kuva. 1) yleisesti ylläpidetty määrä bifidobakteerien, Bacteroides, laktobasillien ja clostridia. E. coli-bakteerien määrä väheni merkitsevästi (p<0, 05) 6 tunnin inkubaation jälkeen, mutta suureni jälleen peruselintasolle (ei näy).

3.2 kaksivaiheinen jatkuva yhdisteviljelyjärjestelmä

astioissa, jotka sisältävät samaa vakioliuosta (pohjaviljelyaine, joka sisältää 1% laktoosia, viikuna. 2), kokonaisbakteerimäärä, bifidobakteerit, laktobasillit ja clostridia pysyivät vakiona. Sen sijaan Bakteroides-pitoisuus lisääntyi merkittävästi molemmissa käymisastioissa tasapainotilan jälkeen ja pysyi vakaassa tilassa korkeammalla kuin inokulaattipitoisuudet molemmissa astioissa (p<0, 05). E. coli-bakteerin osalta havaittiin tilastollisesti merkitsevä aleneminen (p<0, 05) astiassa 2 (pH 6, 5) tasapainotuksen jälkeen. Tämä ei kuitenkaan säilynyt, ja molemmilla astioilla oli vastaavat E. coli-tasot vakaassa tilassa, jotka olivat alhaisemmat kuin siirrosaineella.

2

keskimääräiset bakteerimäärät (log10) ulosteen inokulaatti-ja kontrollifermenttiastioissa, joiden perusaine sisältää 1% laktoosia tai rintamaitoa (BM). Tulokset ovat keskiarvoja (log10 / g tuorepainoa)±S. D. n = siirrosaine ulosteessa; V1TS=astia 1 vakaassa tilassa (pH 5.2); V2TS=astia 2 vakaassa tilassa (pH 6.5).

2

keskimääräiset bakteerimäärät (log10) ulosteen inokulaatissa ja kontrollifermenttiastioissa, joiden pohjaviljelyaine sisältää 1% laktoosia tai rintamaitoa (BM). Tulokset ovat keskiarvoja (log10 / g tuorepainoa)±S. D. n = siirrosaine ulosteessa; V1TS=astia 1 vakaassa tilassa (pH 5.2); V2TS=astia 2 vakaassa tilassa (pH 6.5).

rintamaitoa sisältävien astioiden jälkeen (kuva. 2) lactobasilleilla havaittiin tilastollisesti merkitsevä nousu (p<0, 05) astiassa 2 (pH 6.5), joka säilyi, kunnes vakaa tila saavutettiin. Bifidobakteerien määrä pysyi vakaana. Sen sijaan clostridia laski (p<0, 01) merkitsevästi molemmissa astioissa ja hävisi kokonaan astiasta 1 (pH 5, 2) vakaassa tilassa. Samanlaista vähenemistä (p<0, 05) havaittiin E. coli-bakteerin osalta astiassa 1 (pH 5, 2) mutta ei astiassa 2 (pH 6, 5). Astioissa, jotka sisälsivät α – la: ta ja jotka oli inokuloitu 1-ja 3 kuukauden ikäisiltä lapsilta saaduilla ulostenäytteillä, oli vakaa kokonaislukumäärä samoin kuin muiden bakteerien pitoisuudet (ei esitetty). Kun fermentterit inokuloitiin ulostenäytteillä, jotka saatiin 6 kuukauden ikäisiltä lapsilta (Kuva. 3), kokonais-ja laktobasillimäärät pysyivät muuttumattomina. Bakteroides -, clostridia-ja E. coli-bakteerien määrät laskivat huomattavasti tasapainotuksen jälkeen ja tilastollisesti merkitsevä lasku (p<0, 05) havaittiin molemmilla pH-tasoilla. Astioissa, jotka sisälsivät GMP: tä ja joihin oli inokuloitu ulostenäytteitä 1 ja 3 kuukauden ikäisiltä vauvoilta, oli Kokonaislukumäärät, Bakteroides ja E. coli, jotka vaihtelivat mutta pysyivät vakaina. Kuten α-la: lla havaittiin, laktobasillien suuntaus oli hienoinen nouseva verrattuna alkuperäisiin näytteisiin, mutta tilastollista merkitsevyyttä ei havaittu (ei osoitettu). Kun fermentterit rokotettiin 6 kuukauden ikäisten imeväisten ulosteilla (Kuva. 3), kokonaislukumäärät, laktobasillit ja bifidobakteerit pysyivät ennallaan. Bacteroides -, clostridium-ja E. coli-bakteerimäärät laskivat huomattavasti tasapainotilan jälkeen ja molemmilla pH-tasoilla havaittiin tilastollisesti merkitsevä aleneminen (p<0, 05), joka oli samanlainen kuin α-la-täydennetyllä kaavalla.

3

keskimääräinen bakteerimäärä α-la: ta tai GMP: tä sisältävissä inokulaatti-ja fermentoriastioissa (log10) käyttäen 6 kuukauden ikäisten luovuttajien ulosteita. Tulokset ovat keskiarvoja (log10 / g tuorepainoa)±S. D. n = siirrosaine ulosteessa; V1TS=astia 1 vakaassa tilassa (pH 5.2); V2TS=astia 2 vakaassa tilassa (pH 6.5).

3

α-la: ta tai GMP: tä sisältävien inokulaatti-ja fermentoriastioiden (log10) keskimääräiset bakteerimäärät käyttäen 6 kuukauden ikäisten luovuttajien ulosteita. Tulokset ovat keskiarvoja (log10 / g tuorepainoa)±S. D. n = siirrosaine ulosteessa; V1TS = astia 1 vakaassa tilassa (pH 5.2); V2TS=alus 2 vakaassa tilassa (pH 6,5).

3, 3 orgaaniset hapot

orgaanisten happojen kokonaismäärät vaihtelivat tilastollisesti merkitsevästi (p<0, 05) inokulan ja näytekertojen välillä siten, että inokulan kokonaishapon keskiarvo oli 4, 28 mmol l−1, 8, 16 mmol l−1 ja 15, 64 mmol l−1 verrattuna arvoon 73, 80 mmol/l−1 (vaihteluväli 18, 93–160, 49), 39, 29 mmol l−1 (vaihteluväli 15, 30–100, 28) ja 80, 49 mmol l−1 (vaihteluväli 28, 07–177, 34) 1 -, 3 – ja 6 kuukauden ikäisillä luovuttajilla. Keskivirheet olivat 4.96%, 3.10%, 2.61%, 1.80%, 0.91%, 0.84%, 1.91% ja 5.12% asetaatille, propionaatille, i-butyraatille, n-butyraatille, i-valeraatille, n-valeraatille, kaproaatille ja laktaatille. Asetaatti oli vallitseva happo kaikissa ryhmissä (Fig. 4)jota seuraa laktaatti ja propionaatti, keskimäärin 63%, 21%, 11% kokonaishaposta. d (-) – laktaattia löytyi pääasiassa verrattuna l (+) – laktaattiin, jota esiintyi vain satunnaisesti ja vähäisiä määriä. Tutkimusryhmien välillä ei havaittu tilastollisesti merkitseviä eroja isohappojen, valeraatin ja kaproaatin osalta, joita esiintyi pieninä määrinä.

4

hapon suhteelliset määrät (%) fermentointiastioissa. Ruokavaliot: N=inokulaatti; a-la (α-la)=α-laktalbumiini; GMP=glykomakropeptidi; BM=rintamaito. Luovuttajan ikä: 1=1 kuukausi; 3=3 kuukautta; 6=6 kuukautta syntymän jälkeen.

4

hapon suhteellinen määrä (%) käymisastioissa. Ruokavaliot: N=inokulaatti; a-la (α-la)=α-laktalbumiini; GMP=glykomakropeptidi; BM=rintamaito. Luovuttajan ikä: 1=1 kuukausi; 3=3 kuukautta; 6=6 kuukautta syntymän jälkeen.

ero oli kuitenkin tilastollisesti merkitsevä (p<0.05) ryhmien välillä tärkeimpien happojen ja n-butyraatin suhteellisten määrien osalta. Asetaattia ja laktaattia esiintyi yleensä suhteessa 3:2 lukuun ottamatta 6 kuukauden ikäisten lasten inokulaattia, jossa laktaattia oli eniten (p<0, 01). n-Butyraattipitoisuudet yleensä suurenivat luovuttajan iän myötä, kun taas propionaatti laski, kunnes molempien pitoisuudet olivat suunnilleen yhtä suuret. Pieniä määriä I-butyraattia löydettiin myös kaikista luovuttajaikäisistä ryhmistä sekä rintamaitoryhmästä.

4 Keskustelu

aiempien tutkimusten perusteella yleisesti uskotaan, että rintaruokitut lapset voivat hyötyä mikrobeista, joita bifidobakteerit ja / tai laktobasillit hallitsevat numeerisesti . α-La: n ja GMP: n havaittiin aiemmin stimuloivan merkittävästi valikoituja bifidobakteeriviljelmiä in vitro. Samanlaisia tuloksia ei kuitenkaan nähty täällä sekakulttuurissa. Aikuisten ulostemateriaalilla inokuloiduissa alustavissa eräviljelmissä ei havaittu tilastollisesti merkitsevää vaikutusta hyödylliseen mikrobistoon. Sama koski molempia lisäravinteita, kun niitä käytettiin jatkuvassa viljelmässä, johon oli istutettu ulostemateriaalia eri ikäryhmistä peräisin olevilta lapsilta. Tästä huolimatta bifidobakteerit olivat hallitseva ryhmä sekä testikaavoissa että rintamaitokontrollissa, jossa myös bifidobakteerit pysyivät vakiona koko kokeen ajan. Lactobasilleilla havaittiin voimakkaampi vaikutus. Rintamaito lisäsi merkitsevästi laktobasilleja. Laktobasillien määrässä havaittiin pieni, mutta tilastollisesti merkityksetön nousu GMP: n yhteydessä 3 kuukauden ikäisten imeväisten ulosteissa, mikä jatkui 6 kuukauden ikäisten imeväisten ulostemateriaalilla tehdyissä kokeissa.

molemmilla formulalisillä uskotaan myös olevan jonkin verran estävää vaikutusta erilaisiin patogeeneihin. GMP: llä osoitettiin aiemmin olevan useita antipatogeenisia ominaisuuksia sekä sen hiilihydraattiketjussa, joka sisältää N-asetyylineuramiinihappoa (sialiinihappo), että sen polypeptidiosassa . Sialihappojen esiintyminen suoliston solujen pinnalla on usein välttämätöntä erilaisten enteristen patogeenien tartunnalle ja GMP: n eksogeeninen lähde saattaa estää bakteerien tarttumista, mikä on välttämätöntä tartunnalle. Kawakami on osoittanut tämän estämällä enteropatogeenisen kolibakteerin tarttumista ihmisen suoliston solulinjoihin. Sialihappoa sisältävien ainesosien pitoisuus on yleensä suurempi ihmisen maidossa kuin äidinmaidonkorvikkeissa. GMP: n estävä vaikutus Bacteroidesiin, clostridiaan ja E: hen. tässä tutkimuksessa havaittiin kolibakteeria, kolmea mahdollisesti patogeenistä organismia. Vaikka alustavissa eräviljelmissä, joissa käytettiin aikuisten ulostemateriaalia, pitoisuudet säilyivät yleensä ennallaan, jatkuvassa viljelyssä havaittiin laskeva suuntaus. Näiden organismien tilastollisesti merkitsevä väheneminen havaittiin kuitenkin vain 6 kuukauden ikäisten imeväisten ulosteviljelmissä. Samanlaisia tuloksia havaittiin rintamaidossa, joka vähensi clostridia ja E. coli-bakteereita merkitsevästi Bacteroides – bakteerin pysyessä muuttumattomina. Basaalialustalla sen sijaan Bakteroidipitoisuudet nousivat merkittävästi, mikä osoittaa, että kasviston koostumuksen muutokset eivät johtuneet huuhtoutumisesta vaan riippuivat käymisalustasta.

α-La, joka on laktoosisyntaasin säätelykomponentti, jakaa C-tyypin lysotsyymeille korkean sekvenssiidentiteetin ja sillä on samanlainen kolmiulotteinen rakenne, joka viittaa siihen, että ne ovat peräisin yhteisestä esivanhempien geenistä . On tehty useita tutkimuksia, jotka viittaavat siihen, että α-la: lla voisi olla samankaltaisia vaikutuksia patogeeneihin . Sen sijaan Pelligrini et al. havaittiin, että proteolyyttinen ruoansulatus trypsiinin ja pepsiinin avulla tuotti kolme peptidiä, joilla on bakterisidisia ominaisuuksia ja jotka toimivat enimmäkseen gramnegatiivisia organismeja vastaan. Hydrolysoidun α-LA: n bakteriostaattisia ominaisuuksia havaittiin erityisesti E. coli-bakteereilla. Tässä tutkimuksessa havaittiin α-la: n estävä vaikutus Bakteroideihin, clostridiaan ja E. coli-bakteereihin. Näiden organismien tilastollisesti merkitsevä väheneminen havaittiin vain 6 kuukauden ikäisten imeväisten ulosteviljelmissä, mikä oli verrattavissa rintamaitokontrollien tuloksiin.

tutkimuksemme vahvisti, että asetaatti oli pääasiallinen SCFA-arvo rintaruokinnassa verrattuna pulloruokittuihin imeväisiin sekä pienet propionaattipitoisuudet ja lähes täydellinen butyraatin puuttuminen ensimmäisten 117 elinpäivän aikana . Laktaattia ja asetaattia esiintyi yleensä suhteessa 2: 3, mikä vahvistaa bifidobakteerien hallitsevan roolin mikrobistossa Rasicin ja Kurmannin kuvaamalla tavalla . Laktaatin suuri esiintyvyys on myös tyypillistä epätäydelliselle tai nopealle käymiselle, joka liittyy yleisesti happamaan pH: han, kuten rintaruokinnassa olevilla vauvoilla . Tätä ei kuitenkaan voitu vahvistaa Tässä yhteydessä, koska rintamaitoa käyvien luovuttajien ulosteen inokulaatti tuotti happoprofiilin, jossa ei ollut lainkaan laktaattia. Toisaalta α-la-ja GMP-täydennettyä kaavaa käyvillä ulostenäytteillä saatiin aikaan kaavan käymiselle ominainen happoprofiili, jossa n-butyraattipitoisuudet nousivat luovuttajan iän myötä . Asetaatti oli kuitenkin edelleen vallitseva, kuten yksinomaan rintaruokinnassa olevilla lapsilla.

yhteenvetona olemme osoittaneet α-la: lla ja GMP: llä lisättyjen äidinmaidonkorvikkeiden mikrobiologiset vaikutukset. Verrattuna aiempiin in vitro-tutkimuksiin, joissa käytettiin puhtaita bifidobakteeriviljelmiä, näiden kahden lisäravinteen bifidogeenistä vaikutusta ei havaittu käyttämällä ulosteen inokulaa. Potentiaalisesti patogeenisen mikrobiston havaittiin kuitenkin pienenevän tilastollisesti merkitsevästi, mikä oli samaa luokkaa kuin rintaruokinnassa. Näin ollen tässä yhteydessä voidaan päätellä, että α-la-ja GMP-lisäravinteella yhdessä suurten asetaattimäärien kanssa on suotuisia vaikutuksia ihmisen mikrobistoon.

kiitokset

tutkijat haluavat kiittää Alethea Hilliä sekä lahjoittajia ja heidän vanhempiaan tuesta, innostuksesta ja korvaamattomasta avusta tutkimuksessa.

Borriello
S. P.

(

1986

)

ruoansulatuskanavan Mikrobikasvusto

. In:

Microbial Metabolism in the ruoansulatuskanavan

(

Hill
M. J.

, toim.), PP.

2

16

.

CRC Press

,

Boca Raton, FL

.

Sonnenborn
U.
Stobernack
H.-P.
Proppert
Y.

(

1990

)

anaerobisen suolistoflooran kehittyminen vastasyntyneillä

.

Progress. Med.
108

,

420

424

.

Mitsuoka
T.

(

1995

)

vertaileva suolistomikrobien ekologia ja aineenvaihdunta ihmisellä ja eläimillä

. Vuonna:

anaerobien lääketieteelliset ja hammaslääketieteelliset näkökohdat

(

Duerden
B. I.

Wade
W. G.
Brazier
J. S.

Eley
A.
Wren
B.
Hudson
M. J

, toim.), PP.

87

107

.

Science Reviews

.

Harmsen
H. J. M.
Wildeboer-Veloo
A. C. M.

Raang

div> G. C.

et al. (

2000

)

suolistoflooran kehityksen analysointi rintaruokituilla ja äidinmaidonkorvikkeilla ruokituilla lapsilla käyttäen molekulaarisia tunnistus-ja osoitusmenetelmiä

.

J. Pediatr. Gastroenterolia. Nutr.
30

,

61

67

.

Salminen
S.
Bouley
C.
boutron-Ruault
M.-C.

et al. (

1998

)

Functional food science and gastrointestinal physiology and function

.

Br. J. Nutr.
80

,

S147

S171

.

Harmsen
H. J. M.

Gibson
G. R.

et al. (

1999

)

käyttökelpoisten solujen määrän ja fluoresenssin in situ-hybridisaation Vertailu käyttäen erityisiä rRNA-pohjaisia koettimia ihmisen ulostebakteerien kvantifiointiin

.

FEMS Microbiol. Lett.
183

,

125

129

.

Macfarlane
G. T.

Gibson
G. R.
Macfarlane
S.

(

1994

)

lyhytketjuinen rasvahappo-ja laktaattituotanto ihmisen suolistobakteerien toimesta erä-ja jatkuvuusviljelyssä

. In:

lyhytketjuiset rasvahapot

(

sideaine
H. J.

Cummings

J. H.
Soergel
K. H.

, toim.), PP.

44

60

.

Kluwer Publishing

,

London

.

Allison
C.
McFarlan
C.
Macfarlane
G. T.

(

1989

)

tutkimukset ihmisen suolistobakteerien sekapopulaatioilla, jotka on kasvatettu yhden ja monivaiheisen jatkuvan viljelyn järjestelmissä

.

Appl. N. Mikrobiolia.
55

,

679

683

.

Marsh
P.

(

1995

)

jatkuvan viljelyn rooli ihmisen mikrobiston mallintamisessa

.

J. Chem. Teknologia. Bioteknologiaa.
64

,

1

9

.

Veilleux
B. G.
Rowland
I.

(

1981

)

simulointi rotan suolistosta ekosysteemi, jossa käytetään kaksivaiheista jatkuvan viljelyn järjestelmää

.

J. Gen. Microbiol.
123

,

103

115

.

Macfarlane
G. T.
Macfarlane
S.
Gibson
G.

(

1998

)

the validation of a three-stage compound continuous culture system for investigation the effect of Retention time on the ecology and metabolism of bacteries In The Human Colon

.

Mikrob. Ecol.
35

,

180

187

.

Edwards
C. A.

Parrett
A. M.
Balmer
s.e.

Wharton
B. A.

(

1994

)

ulosteen lyhytketjuiset rasvahapot imetetyillä ja äidinmaidonkorviketta saaneilla vauvoilla

.

Acta Paedatr.
83

,

459

462

.

Cummings

J. H.

(

1983

)

Fermentation in the human colour: Evidence and implications for health

.

Lancet
1

,

1206

1208

.

Midtvedt
T.
Carlstedt-Duke
B.
Høverstad
T.

et al. (

1986

)

peroraalisen mikrobilääkkeen vaikutus suoliston mikrobiston biotransformatoriseen aktiivisuuteen terveellä koehenkilöllä

.

Eur. J. Blink. Sijoittaa.
16

,

11

17

.

Kawakami
H.

(

1997

)

Biological significance of sialic acid-containing substances in milk and their application

.

Recent Res. Dev. Agric. Biol. Chem.
1

,

193

207

.

Idota
T.

Kawakami
H.

Nakajima
I.

(

1994

)

Growth-promoting effects of N-actelylneuraminic acid containing substances on bifidobacteria

.

Biosci. Biotechnol. Biochem.
58

,

1720

1722

.

Bouhallab
S.

favrot
C.
Maubois
J. L.

(

1993

)

kasvua edistävä activity of tryptic digest of caseinomacropeptide for Lactococcus lactis ssp. lactis

.

maito
73

,

73

77

.

Xue
Y.

lui
J. N.

Sun
Z.
Matte

Z.

Wu
C.
Zhu
D.

(

2001

)

α-laktalbumiinimutantti, joka toimii lysotsyyminä

.

proteiinien rakenne. Funct. Genet.
42

,

17

22

.

Pihlanto-Lappälä
A.
marnila
P.

Hubert
L.

Rokka
T.

Korhonen

H. J. T.

Carpal
M.

(

1999

)

α-laktalbumiinin ja β-laktalbumiinin hydrosylaattien vaikutus Escherichia colin metaboliseen aktiivisuuteen jm103

.

J. Appl. Mikrobiolia.
87

,

540

545

.

Petschow
B. W.
Talbott

D.

(

1991

)

Bifidobacterium lajeista kasvun edistäjiin ihmisen ja lehmän maidossa

.

Pediatr.
29

,

208

213

.

Franks
A. H.
Harmsen
H. J. M.

Raang
G. C.

et al. (

1998

)

Bakteeripopulaatioiden vaihtelut ihmisen ulosteessa mitattuna fluoresoivalla in situ-hybridisaatiolla ryhmäspesifisillä 16S rRNA-kohdennetuilla oligonukleotidikoettimilla

.

Appl. N. Mikrobiolia.
64

,

3336

3345

.

Neeser
J. R.
Golliard

M.

Woltz
A.

rouvet

M.

Dillmann
M. L.

Guggenheim
B.

(

1994

)

in oraalisen bakteerien adheesion modulaattori syljellä päällystettyihin hydroksipatiittihelmiin maidon kaseiinijohdannaisilla

.

oraalinen Mikrobioli. Immunol.
9

,

193

201

.

Wold
A. E.
Adlerberth
I.

2000

intestinal mikrofloora of the infant-implications for protection against infectious diseases

. Julkaisussa:

short and Long Term Effects of Breasting Feeding on Child Health

(

Keletzo
B.

et al. , Toim.).

Kluwer Academic/Plenum Publishers

,

New York

.

Pelligrini
A.

Thomas
U.
Bramaz
N.
Hunziker
P.

von Fellenberg

(

1999

)

kolmen bakterisidisen domeenin eristäminen ja tunnistaminen enkefalopatian alfa-laktalbumiinimolekyylissä

.

Biochim. Biofyysejä. Acta
1426

,

439

448

.

Siigur
U.

Ormission
A.

Tamm
A.

(

1993

)

ulosteen lyhytketjuiset rasvahapot rintaruokinnassa ja pulloruokinnassa

.

Acta Paedatr.
82

,

536

538

.

Wolin
M. J.
Yerry

S.

Miller
T. L.
zhang
Y.
Pankki
S.

(

1998

)

muutokset etanolin, happojen ja H2: n tuotannossa glukoosista 16-158 päivää vanhan rintaruokitun lapsen ulosteen vaikutuksesta

.

J. Nutr.
128

,

85

90

.

Rasic
J. L.
Kurmann
J. A.

(

1983

)

bifidobakteerit ja niiden rooli

.

Birkhauser Verlag

,

Basel

.

Tianan
J.

Savaiano
D. A.

(

1997

)

bifidobakteerien suolikäymisen muokkaus ja pH in vitro

.

Dig. Kymmenen. Sci.
42

,

2370

2377

.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.