Uso de cultivo por lotes y un sistema de cultivo continuo de dos etapas para estudiar el efecto de α-lactalbúmina y glicomacropéptido suplementarios en poblaciones mixtas de bacterias intestinales humanas

Resumen

Ciertos factores de la leche pueden promover el crecimiento de una microflora gastrointestinal amigable para el huésped. Esto puede explicar por qué los bebés amamantados experimentan menos infecciones intestinales que sus homólogos alimentados con fórmula. En este estudio se investigó el efecto de la suplementación con fórmula con dos de estos factores. Se utilizaron muestras fecales infantiles para fermentar fórmulas suplementadas con glicomacropéptido y α-lactoalbúmina en un modelo de cultivo continuo compuesto de dos etapas. La bacteriología se determinó mediante hibridación fluorescente in situ. Los vasos que contenían leche materna, así como α-lactoalbúmina y glicomacropéptido, presentaron recuentos estables de bifidobacterias, mientras que los lactobacilos aumentaron significativamente solo en los vasos con leche materna. Bacteroides, clostridios y Escherichia coli disminuyeron significativamente en todas las corridas. El acetato fue el ácido principal encontrado junto con altas cantidades de propionato y lactato. La suplementación de preparados para lactantes con proteínas de leche adecuadas puede ser útil para simular los efectos bacteriológicos beneficiosos de la leche materna.

1 Introducción

El intestino grueso humano es un ecosistema complejo que alberga una amplia gama de bacterias. Se cree que al menos 400 especies bacterianas diferentes están presentes en un momento dado, con hasta 1012 bacterias encontradas por g de heces . La microflora se adquiere al nacer, y el recién nacido estéril se coloniza por varias bacterias durante el proceso de parto . Durante los primeros días de vida, nutricionalmente poco exigente procariotas como enterobacterias, estafilococos y estreptococos (incluyendo enterococos) predominan. En la primera semana de vida, géneros como bifidobacterias y Bacteroides se establecen . Se cree que los bebés alimentados con leche materna tienen una flora colónica que está dominada numéricamente por bifidobacterias, mientras que los alimentados con leche artificial tienen una microbiota más compleja que es similar en composición a la de los adultos . Las bifidobacterias pueden ejercer poderosos efectos antimicrobianos contra una variedad de patógenos intestinales, como ciertas enterobacteriáceas y Clostridium spp. Como tal, un predominio de bifidobacterias se ve como un indicador de una mejor salud intestinal . Las observaciones sobre la microflora intestinal normal se han derivado en gran medida del cultivo cuantitativo de placas y la caracterización fenotípica, que tienen limitaciones en términos de eficiencia de recuperación y subjetividad del operador .

Además, como el colon proximal es físicamente inaccesible para fines rutinarios, la mayoría de los estudios microbianos sobre fermentación se han llevado a cabo con bacterias fecales en cultivos por lotes o quimiostáticos de una sola etapa . El cultivo por lotes permite determinar la fermentabilidad de varios sustratos durante períodos cortos (24 h). Sin embargo, existen marcadas diferencias en la disponibilidad de sustrato y en las condiciones ambientales entre el colon proximal y distal, que no se pueden simular en un solo sistema de vasos .

Por el contrario, los sistemas in vitro que utilizan recipientes de fermentación múltiples alineados en serie tienen ventajas al ser capaces de modelar condiciones ambientales más complejas al tiempo que permiten la heterogeneidad espacial y temporal . Por ejemplo, se demostró que un quimiostato de dos etapas con reciclaje celular de la segunda a la primera etapa producía resultados satisfactorios . Macfarlane et al.llevaron a cabo un mayor refinamiento para modelar el colon humano adulto. utilizando un sistema de cultivo continuo compuesto de tres etapas. Esto fue validado microbiológicamente contra material colónico humano obtenido de víctimas de muerte súbita en la autopsia. Estos modelos son valiosos para estudiar la microflora intestinal, ya que se pueden controlar diferentes condiciones fisicoquímicas. Esto tiene claras ventajas económicas, pero es especialmente relevante para la planificación de estudios en humanos.

Las diferencias en la flora fecal también se reflejan en diferentes patrones de ácidos grasos de cadena ramificada, de lactato corto y de cadena corta, que son productos intermedios y finales de la fermentación bacteriana . Su tasa de producción y patrón de fermentación también pueden determinarse por la disponibilidad de sustrato para la flora bacteriana intestinal . Por lo tanto, los cambios en la flora fecal a partir de una alteración en la dieta, o la terapia antimicrobiana, también pueden provocar un cambio en los patrones de fermentación y la concentración de ácido orgánico . La cantidad de tales ácidos producidos en seres humanos es difícil de determinar y solo se han llevado a cabo un pequeño número de estudios que indican que en adultos, se producen entre 300 mmol y 1-2 mol de ácido cada día. Se encontró que el acetato era el principal AGCS producido en todos los casos y la evidencia sugiere que las concentraciones de AGCS en ciego son aproximadamente el doble de las del área recto-sigmoide .

Dos componentes de la leche han demostrado previamente inhibir las infecciones gastrointestinales y / o estimular las bifidobacterias in vitro. El glicomacropéptido (GMP), un derivado de la κ-caseína, ha sido ampliamente estudiado in vitro y se ha demostrado que inhibe la adhesión de bacterias, virus y toxinas a la membrana celular a través de la unión a los sitios receptores del patógeno . Estos ensayos in vitro también mostraron que el GMP promovió fuertemente el crecimiento de Bifidobacterium breve, B. bifidum, B. infantis y Lactococcus lactis. se ha demostrado que la α-lactoalbúmina (α-la), que tiene una estructura terciaria comparable a las lisozimas de tipo c, tiene efectos similares . Pihlanto-Leppälä et al. previamente demostró que α-la redujo la actividad metabólica de Escherichia coli JM103 a solo el 21% de lo normal. Además, las pruebas de leche de vaca purificada mostraron que α-la era un potente promotor del crecimiento de B. infantis y B. breve.

En este estudio, utilizamos cultivo por lotes y un sistema de cultivo continuo compuesto de dos etapas para probar las propiedades de fermentación y las actividades bacterianas después de la suplementación de alimentos de fórmula para bebés con α-la y GMP. El sistema de cultivo continuo fue adaptado del modelo de tres etapas desarrollado por Macfarlane et al. . Su volumen de operación más pequeño y sus tasas de rotación más rápidas intentaron tener en cuenta los factores físicos que se encuentran en los bebés humanos. Probamos si la suplementación de α-la y GMP puede alterar la flora gastrointestinal para proporcionar beneficios similares a los observados en bebés amamantados.

2 Materiales y métodos

2.1 Cultivo por lotes

Para los sistemas de cultivo por lotes anaeróbicos, el medio de cultivo basal contenido (por litro): 1 g de peptona, 1 g de extracto de levadura, 0.05 g de NaCl, 0.02 g de K2HPO4, 0.02 g de KH2PO4, 0.005 g de MgSO4·7H2O, 0.005 g de CaCl2·6H2O, 1 g NaHCO3, 1 ml de interpolación 80, 0.0025 g de hemina, 5 µl de vitamina K1, 0,25 g de cisteína HCl y 0,25 g de sales biliares disueltas en 500 ml de agua desionizada, ajustada a pH 7,0 y esterilizada mediante autoclave. Todos los productos químicos se obtuvieron de Sigma (Poole, Dorset, Reino Unido) a menos que se indique lo contrario. Se colocó medio estéril (50 ml) en frascos de cultivo por lotes de 100 ml que contenían 0,5 g (1% p/v) de una fórmula de prueba (Arla Foods Ingredients, Viby, Dinamarca) suplementada con α-la (68% p/v) o GMP (80% p/v) y mantenida en una atmósfera de gas nitrógeno libre de oxígeno. Las fórmulas se compararon con un estándar que contenía 1% (p/p) de lactosa. Al día siguiente, se recogió una muestra fecal fresca en una bolsa de stomacher y se procesó de inmediato. El experimento se repitió cinco veces con cinco donantes diferentes.

Los recipientes de cultivo por lotes se inocularon con 5 ml de una suspensión fecal al 10% (p / v) de voluntarios adultos sanos preparados con solución salina anaeróbica tamponada con fosfato (PBS, 0,1 M, pH 7,2) y se tomaron muestras de 1 ml a las 0 horas (antes de colocar la muestra en el cultivo por lotes), 6 h y 24 h y se almacenaron a 4°C hasta su uso posterior. Para el recuento de bacterias mediante hibridación fluorescente in situ (FISH), se retiraron triplicados de 375 µl de muestra recogida y se añadieron a un tubo Eppendorf de 1,5 ml que contenía 1125 µl de paraformaldehído al 4% (p/v) esterilizado con filtro en PBS (pH 7,2) y se fijaron durante al menos 4 h a 4°C. A continuación, la muestra fija se centrifugó durante 5 minutos a 13 000×g y se desechó el sobrenadante. El pellet se resuspendió en 1 ml de PBS filtrado (pH 7,4) que contenía 0,00001% (p/v) de bromuro de cetil trimetil amonio y se transfirió a un tubo Eppendorf para repeler (13 000×g, 5 min). Después de lavar el pellet por segunda vez, se retiró el sobrenadante y el pellet se resuspendió completamente en 150 µl de PBS filtrado y 150 µl de etanol al 96% (v/v). La muestra se mezcló bien y se almacenó a -20 ° C durante al menos 1 hora antes de la hibridación con una sonda fluorescente (como se describe a continuación).

2.2 Sistema de cultivo continuo de dos etapas

El sistema de cultivo continuo consistía en dos recipientes de vidrio, V1 y V2, ambos con un volumen de funcionamiento de 100 ml. La temperatura (37 ° C) y el pH se controlaron automáticamente. El pH de cultivo en los vasos fue de 5.2 en V1, representando el ambiente de pH bajo del colon proximal y 6,5 en V2, indicativo de un pH más neutro en el colon distal. Cada fermentador se agitó magnéticamente y el medio de crecimiento se roció continuamente con nitrógeno libre de oxígeno (15 ml min-1) y se alimentó de un depósito de medio de vidrio mediante una bomba peristáltica (Watson-Marlow, Falmouth, Reino Unido) a V1. V1 se suministra secuencialmente V2 a través de un desbordamiento y una serie de presas. El desbordamiento de V2 fue llevado a un contenedor de residuos. El medio de cultivo consistió en (A) el medio basal descrito anteriormente con un 1% (p/v) de lactosa añadida (Sigma, Poole, Dorset, Reino Unido), (B) leche materna humana (proporcionada por el Hospital Royal Berkshire, Reading, Reino Unido) con 0,5 g de l−1l-cisteína-HCl añadida, (C) fórmula de prueba con un 68% (p/v) de α-la suplementario, un 1% (p/v) de lactosa y 0,5 g de l−1l-cisteína-HCl, y (D) fórmula de prueba con un 68% (p/v) GMP, lactosa al 1% (p/v) y 0,5 g de l−1l-cisteína-HCl. Todas las fórmulas se obtuvieron de ingredientes de Arla Foods (Viby, Dinamarca) y se predigerieron utilizando pepsina (575 U por g de proteína) a pH 2 durante 2 h (37°C), seguida de pancreatina (50 U por g de proteína) y ácido biliar de volumen l−1 de 0,5 g a pH 6,5 durante dos h (37°C). Para garantizar la anaerobicidad, se hervieron 4 ml de l−1 de una solución madre l−1 de 250 mg de resazurina y se añadieron al medio. Los medios se calentaron a 80 ° C durante 20 minutos, se enfriaron a temperatura ambiente durante la noche y se calentaron a 80°C durante otros 20 minutos antes de ser rociados continuamente con N2 libre de O2. El sistema funcionó a un tiempo de retención (R) de 12 h calculado como el recíproco de la velocidad de dilución. El tiempo de retención del sistema constituía la suma de los valores R individuales en cada fermentador. Cada fermentador se inoculó con 15 ml de una mezcla fecal fresca al 10% (p/v) de donantes sanos de bebés de entre 1 y 6 meses de edad y se alimentó con leche materna con fórmula complementaria. El purín se preparó con 0,1 M de PBS anaeróbicos (pH 7,2). Todos los experimentos se repitieron cinco veces con diferentes donantes, a excepción del grupo B (leche materna), donde el experimento se llevó a cabo una vez con material fecal de un donante de 3 meses alimentado exclusivamente con leche materna. Los grupos C y D contenían cada uno cinco individuos diferentes. Se tomaron muestras después de 1, 3 y 6 meses de edad para evaluar cualquier diferencia en la microflora fecal y cualquier cambio en la efectividad de los suplementos a medida que los bebés maduraban. Se permitió que el sistema de fermentación se equilibrara durante la noche antes de que se iniciara la bomba de medio, y se ejecutó durante al menos 144 h para establecer condiciones de estado estacionario. se tomaron muestras de 3 ml del inóculo original (N), después del equilibrio (T0) y en condiciones de estado estacionario (TS) y se prepararon para el análisis de PECES como se describió anteriormente.

2.3 Enumeración bacteriana a través de sondas de oligonucleótidos de PECES

(Tabla 1) para Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp./ Enterococo, Bacteroides spp. , Grupo Clostridium histolyticum y E. los coli fueron sintetizados y monomarcados en el extremo 5′ con Cy3 (Ex 552 nm, Em 568 nm) por Eurogentec (Abingdon, Reino Unido) o MWG-Biotech (Milton Keynes, Reino Unido). La hibridación se realizó durante la noche a 50°C para Bifidobacterium y Clostridium, a 45°C para Lactobacillus y Bacteroides y a 37°C para E. coli. Para la hibridación, se añadieron 200 µl de tampón filtrado (40 mm Tris–HCl pH 7,2, 1,8 M NaCl) que contenían 20 ml l−1 de SDS al 10% (p/v) y 64 µl de agua para HPLC a 16 µl de células fijas y se calentaron a la temperatura adecuada. Se añadió una solución de hibridación precalentada (90 µl) a 10 µl de la sonda adecuada (concentración final de 50 ng µl−1) y la solución se incubó durante la noche en un horno de hibridación. Para la sonda de E. coli, se añadieron 264 µl de tampón de hibridación con un 35% (v/v) de formamida a 16 µl de células fijas. Las células se lavaron añadiendo 5 ml de tampón de lavado (20 mm Tris–HCl pH 7,2, 0,9 M NaCl) a 5-100 µl de muestra hibridada, teñida con 20 µl 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Ex 344, Em 450; 500 ng ml−1) y se incubaron en un horno de hibridación durante 30 min. Para los recuentos totales, 5-12 µl de muestra se filtraron al vacío en un filtro de policarbonato de tamaño de poro de 0,2 µm (Miliporo, Watford, Reino Unido) y se colocaron en un portaobjetos de microscopio. Para evitar la decoloración de las sondas, se añadió al filtro una gota del componente A del Kit Antifade de luz lenta (Molecular Probes Europe, Leiden, Países Bajos). Los portaobjetos se examinaron microscópicamente utilizando un accesorio de EPI-fluorescencia (Nikon UK, Kingston upon Thames, UK). Se utilizó luz UV para contar bacterias teñidas con DAPI y se enumeraron células teñidas con Cy3 a 550 nm. Se contaron quince campos aleatorios con una buena distribución de células (10-100) para cada sonda y muestra.

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Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

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Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

2.4 Volatile acid analysis

Undiluted aliquots (1.0 ml) de muestra se dispensaron en tubos Eppendorf de 1,5 ml y se centrifugaron (13 000×g, 5 min) para pelar bacterias y otros sólidos. El sobrenadante se filtró con un filtro de policarbonato de 0,2 µm y se añadió a cuatro partes de acetonitrilo que contenían 4,3 mmol l-1 de ácido 2-etilbutírico como patrón interno. La calibración se realizó utilizando soluciones estándar de ácido acético, ácido propiónico, i-butírico ácido n-butírico, i-ácido valeriánico, n-ácido valeriánico, n-caproico, y dl-láctico en acetonitrilo. Los ácidos grasos se determinaron mediante cromatografía gas-líquido en un sistema GC de la serie Agilent 6890 (Agilent, Waldbronn, Alemania) equipado con una columna Optima FFAP (25 m×0,32 mm, Macherey-Nagel, Düren, Alemania) y un detector de ionización de llama. El helio de gas portador se suministró a un caudal de 1,8 ml min-1. El inyector, la columna y el detector se ajustaron a 220°C, 140°C (isotérmico) y 220°C, respectivamente. Después de 5 minutos, la temperatura de la columna se aumentó a 240 ° C a incrementos de 20 ° C min−1 para funcionar durante otros 15 minutos. Los picos se integraron utilizando un PC que ejecutaba el software de gestión Atlas Lab (Thermo Lab Systems, Mainz, Alemania). Las concentraciones de ácidos grasos se calcularon comparando sus zonas de pico con las del patrón interno y se expresaron en milimoles por litro.

2,5 Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA unidireccional (inóculo, versus estado estacionario, TS) para determinar la significación a P<0,05 a menos que se indique lo contrario.

3 Resultados

3.1 Cultivo por lotes

Antes de la inoculación, las muestras contenían números casi idénticos de Bifidobacterium spp., Bacteroides spp. y Clostridium spp. Los lactobacilos fueron menos numerosos. En cultivos que contienen α-la (Fig. 1), los recuentos totales, bifidobacterias, clostridios, lactobacilos y bacteroides permanecieron inalterados. Los recuentos de E. coli disminuyeron significativamente (P<0,01) con la suplementación con α-la después de 6 h de incubación, pero volvieron a aumentar a los niveles basales (no se muestran).

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Recuento bacteriano medio (log10) en inóculos fecales adultos y cultivos de lotes que contienen medio basal con lactosa al 1% (p/p) o fórmula de prueba al 1% (p/p). Los resultados son medias (log10 por g de peso húmedo)±D. S. N=inóculo fecal; 24 h, lactosa=cultivo después de 24 h de incubación que contiene lactosa; 24 h, a-la/GMP=cultivo después de 24 h de incubación que contiene α-la o GMP.

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Recuento bacteriano medio (log10) en inóculos fecales adultos y cultivos por lotes que contienen medio basal con lactosa al 1% (p/p) o fórmula de prueba al 1% (p / p). Los resultados son medias (log10 por g de peso húmedo)±D. S. N=inóculo fecal; 24 h, lactosa=cultivo después de 24 h de incubación que contiene lactosa; 24 h, a-la/GMP=cultivo después de 24 h de incubación que contiene α-la o GMP.

Cultivos que contienen GMP (Fig. 1) generalmente se mantienen números de bifidobacterias, Bacteroides, lactobacilos y clostridios. El recuento de E. coli disminuyó significativamente (P<0,05) después de 6 h de incubación, pero, de nuevo, aumentó a niveles basales (no se muestra).

3.2 Sistema de cultivo continuo compuesto de dos etapas

En recipientes que contienen el mismo medio estándar (medio basal que contiene 1% p/p de lactosa, Fig. 2), el recuento total de bacterias, bifidobacterias, lactobacilos y clostridios se mantuvo constante. Por el contrario, los bacteroides aumentaron significativamente en ambos recipientes de fermentación después del equilibrio y permanecieron más altos que los niveles de inóculo en estado estacionario en ambos recipientes (P<0,05). Se observó una disminución estadísticamente significativa (P<0,05) para E. coli en el vaso 2 (pH 6,5) después del equilibrio. Sin embargo, esto no se mantuvo y ambos vasos tenían niveles comparables de E. coli en el estado estacionario, que eran más bajos que el inóculo.

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Recuento bacteriano medio (log10) en recipientes de inóculo fecal y fermentador de control con medio basal que contiene 1% (p/p) de lactosa o leche materna (MB). Los resultados son medias (log10 por g de peso húmedo)±D. S. N=inóculo fecal; V1TS=vaso 1 en estado estacionario (pH 5,2); V2TS=vaso 2 en estado estacionario (pH 6,5).

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Recuentos medios de bacterias (log10) en recipientes de inóculo fecal y fermentador de control con medio basal que contiene 1% (p / p) de lactosa o leche materna (MB). Los resultados son medias (log10 por g de peso húmedo)±D. S. N=inóculo fecal; V1TS=vaso 1 en estado estacionario (pH 5,2); V2TS=vaso 2 en estado estacionario (pH 6,5).

Después de los vasos que contienen leche materna (Fig. 2) se dejaron equilibrar durante 24 h, se observó un aumento estadísticamente significativo (P<0,05) para los lactobacilos en el vaso 2 (pH 6.5), que se mantuvo hasta alcanzar el estado estacionario. Los recuentos de bifidobacterias se mantuvieron estables. Por el contrario, los clostridios disminuyeron (P<0,01) significativamente en ambos vasos y desaparecieron completamente del vaso 1 (pH 5,2) en estado estacionario. Se observaron disminuciones similares (P<0,05) para E. coli en el vaso 1 (pH 5,2) pero no en el vaso 2 (pH 6,5). Los vasos que contenían α-la e inoculados con muestras fecales obtenidas de bebés de 1 y 3 meses de edad tenían recuentos totales estables, así como niveles de otras bacterias (no mostrados). Cuando los fermentadores se inocularon con muestras fecales obtenidas de bebés de 6 meses de edad (Fig. 3), los recuentos totales y los recuentos de lactobacilos se mantuvieron sin cambios. Los recuentos de bacteroides, clostridios y E. coli disminuyeron notablemente después del equilibrio y se observó una reducción estadísticamente significativa (P<0,05) en ambos niveles de pH. Los recipientes que contenían GMP e inoculados con muestras fecales de bebés de 1 y 3 meses de edad tenían recuentos totales, Bacteroides y E. coli que fluctuaban pero se mantenían estables. Como se observó con α-la, los lactobacilos mostraron una ligera tendencia al alza en comparación con las muestras iniciales, pero no se observó significación estadística (no se mostró). Cuando los fermentadores se inocularon con heces de bebés de 6 meses de edad (Fig. 3), los recuentos totales, los lactobacilos y las bifidobacterias se mantuvieron sin cambios. Los recuentos de bacteroides, clostridium y E. coli disminuyeron notablemente después del equilibrio y se observó una reducción estadísticamente significativa (P<0,05), similar a la observada con la fórmula suplementada con α-la, en ambos niveles de pH.

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Recuentos medios de bacterias en recipientes de inóculo y fermentador (log10) que contienen α-la o GMP utilizando heces de donantes de 6 meses de edad. Los resultados son medias (log10 por g de peso húmedo)±D. S. N=inóculo fecal; V1TS=vaso 1 en estado estacionario (pH 5,2); V2TS=vaso 2 en estado estacionario (pH 6,5).

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Recuentos medios de bacterias en recipientes de inóculo y fermentador (log10) que contienen α-la o GMP utilizando heces de donantes de 6 meses de edad. Los resultados son medias (log10 por g de peso húmedo)±D. S. N = inóculo fecal; V1TS = vaso 1 en estado estacionario (pH 5,2); V2TS = vaso 2 en estado estacionario (pH 6,5).

3.3 ácidos Orgánicos

el Total de las cantidades de ácidos orgánicos variado de manera significativa estadísticamente (P<0.05) entre los inóculos y de la muestra de veces, con una media total de ácidos para los inóculos se 4.28 mmol l−1, 8.16 mmol l−1 y 15.64 mmol l−1 en comparación con el 73.80 mmol/l−1 (rango de 18.93–160.49), 39.29 mmol l−1 (rango 15.30–100.28) y 80.49 mmol l−1 (rango 28.07–177.34) para 1, 3 y 6 meses de edad de los donantes, respectivamente. Los errores estándar fueron 4.96%, 3.10%, 2.61%, 1.80%, 0.91%, 0.84%, 1.91% y 5.12% para acetato, propionato, i-butirato, n-butirato, i-valerato, n-valerato, caproato y lactato, respectivamente. El acetato fue el ácido predominante en todos los grupos (Fig. 4) seguido de lactato y propionato, con un promedio de 63%, 21% y 11% del ácido total, respectivamente. se encontró predominantemente d ( – ) – lactato en comparación con l ( + ) – lactato, que solo ocurrió esporádicamente y en cantidades mínimas. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de estudio para isoácidos, valerato y caproato, que ocurrieron en cantidades mínimas.

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Cantidades relativas medias ( % ) de ácido en recipientes fermentadores. Dietas: N = inóculo; a-la (α-la)=α-lactoalbúmina; GMP=glicomacropéptido; BM=leche materna. Edad del donante: 1 = 1 mes; 3=3 meses; 6 = 6 meses después del nacimiento.

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la Media de las cantidades relativas (%) de ácido en el fermentador vasos sanguíneos. Dietas: N = inóculo; a-la (α-la)=α-lactoalbúmina; GMP=glicomacropéptido; BM=leche materna. Edad del donante: 1 = 1 mes; 3=3 meses; 6 = 6 meses después del nacimiento.

sin embargo, hubo una diferencia estadísticamente significativa (P<0.05) entre los grupos para las cantidades relativas de los ácidos principales y el n-butirato. El acetato y el lactato se presentaron generalmente en una proporción de 3: 2, con la excepción del inóculo de niños de 6 meses de edad, donde predominó el lactato (P<0,01). las concentraciones de n-butirato aumentaron generalmente con la edad del donante, mientras que el propionato disminuyó hasta que ambas concentraciones fueron aproximadamente iguales. También se encontraron pequeñas cantidades de i-butirato en todos los grupos de edad de donantes, así como en el grupo de leche materna.

4 Discusión

De acuerdo con estudios previos, se cree generalmente que los lactantes pueden beneficiarse de la microbiota dominada numéricamente por bifidobacterias y/o lactobacilos . se encontró previamente que α-La y GMP estimulaban significativamente cultivos puros seleccionados de bifidobacterias in vitro. Sin embargo, no se observaron resultados similares en cultivos mixtos. En cultivos de lotes preliminares inoculados con material fecal adulto, no se observó un efecto estadísticamente significativo sobre la microflora beneficiosa. Lo mismo ocurrió con ambos suplementos cuando se utilizaron en cultivos continuos inoculados con material fecal de bebés de varios grupos de edad. A pesar de esto, las bifidobacterias fueron el grupo dominante tanto en las fórmulas de prueba como en el control de la leche materna, donde las bifidobacterias también se mantuvieron constantes durante todo el experimento. Se observó un efecto más profundo para los lactobacilos. La leche materna aumentó significativamente los lactobacilos. Se observó un aumento menor, pero estadísticamente insignificante, de los recuentos de lactobacilos con GMP en las heces de bebés de 3 meses de edad, una tendencia que continuó en experimentos con material fecal de bebés de 6 meses de edad.

Ambos suplementos de fórmula también se cree que poseen algún efecto inhibitorio sobre una variedad de patógenos. Se ha demostrado previamente que el GMP tiene varios atributos anti-patógenos tanto en su cadena de carbohidratos que contiene ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico) como en su porción polipeptídica . La presencia de ácidos siálicos en la superficie de las células intestinales a menudo se requiere para la infección de una variedad de patógenos entéricos y una fuente exógena de GMP podría inhibir la adhesión bacteriana, que es esencial para la infección. Esto ha sido demostrado por Kawakami al inhibir la adherencia de E. coli enteropatógena a líneas celulares intestinales humanas. En general, la concentración de componentes que contienen ácido siálico es mayor en la leche materna que en las fórmulas infantiles. Un efecto inhibidor de GMP sobre Bacteroides, clostridios y E. en este estudio se observaron coli, tres organismos potencialmente patógenos. Mientras que en los cultivos preliminares por lotes en los que se utilizaron materiales fecales adultos se conservaron generalmente los recuentos, se observó una tendencia a la baja en los cultivos continuos. Sin embargo, solo se detectó una reducción estadísticamente significativa de estos organismos en cultivos con material fecal de bebés de 6 meses de edad. Se observaron resultados similares en la leche materna, que disminuyeron significativamente los clostridios y E. coli, mientras que los bacteroides permanecieron inalterados. Por el contrario, el medio basal aumentó significativamente los niveles de Bacteroides, lo que muestra que los cambios en la composición de la flora no fueron el resultado del lavado, sino que dependieron del medio de fermentación.

α-La, un componente regulador de la lactosa sintasa, comparte un alto nivel de identidad de secuencia con las lisozimas de tipo c y tiene una estructura tridimensional similar que sugiere que provienen de un gen ancestral común . Se han realizado varios estudios para sugerir que α-la podría tener efectos similares sobre los patógenos . En contraste, Pelligrini et al. encontró que la digestión proteolítica por tripsina y pepsina produjo tres péptidos con propiedades bactericidas, la mayoría activos contra organismos gramnegativos. Las propiedades bacteriostáticas de α-la hidrolizado se observaron específicamente para E. coli. En este estudio se observó un efecto inhibidor de α-la sobre Bacteroides, clostridios y E. coli. Una vez más, solo se detectó una reducción estadísticamente significativa de estos organismos en cultivos con material fecal de bebés de 6 meses de edad, un resultado comparable al obtenido para los controles de leche materna.

Nuestro estudio confirmó que el acetato fue el principal AGCS en lactantes en comparación con los lactantes alimentados con biberón, junto con bajas concentraciones de propionato y una ausencia casi total de butirato en los primeros 117 días de vida . El lactato y el acetato generalmente se presentaron en una proporción de 2:3, lo que confirma el papel predominante de las bifidobacterias en la microflora descrito por Rasic y Kurmann . Una alta incidencia de lactato también es típica de la fermentación incompleta o rápida, comúnmente asociada con un pH ácido, como se observa en los bebés amamantados . Sin embargo, esto no se confirmó aquí, ya que el inóculo fecal de donantes alimentados con leche materna que fermentaban produjo un perfil ácido casi completamente desprovisto de lactato. Por otro lado, las muestras fecales que fermentaban la fórmula complementada con α-la y GMP produjeron un perfil ácido característico de la fermentación de la fórmula con concentraciones más altas de n – butirato, que aumentaron con la edad del donante . Sin embargo, el acetato siguió siendo predominante, como se ha observado en los lactantes alimentados exclusivamente con leche materna.

En resumen, hemos demostrado los efectos microbiológicos de la suplementación de fórmulas infantiles con α-la y GMP. En comparación con estudios in vitro previos en los que se utilizaron cultivos puros de bifidobacterias, no se observó un efecto bifidogénico de los dos suplementos utilizando inóculos fecales. Sin embargo, se observó una reducción estadísticamente significativa de la microflora potencialmente patógena, similar a la observada en lactantes. Por lo tanto, en este contexto, se puede concluir que la suplementación con α-la y GMP en combinación con altas cantidades de acetato tiene efectos beneficiosos sobre la microflora humana.

Agradecimientos

Los investigadores desean agradecer a la Sra. Alethea Hill, así como a los donantes y a sus padres por su apoyo, entusiasmo e inestimable ayuda para el estudio.

Borriello
S. P.

(

1986

)

flora Microbiana del tracto gastrointestinal

. En:

Metabolismo microbiano en el Tracto Digestivo

(

Hill
M. J.

, Ed.), pp.

2
16

.

CRC Press

,

Boca Raton, FL

.

De Sonnenborn
U.

Stobernack
H. P.

Proppert
Y.

(

1990

)

El desarrollo de la flora intestinal en recién nacidos

. Progreso

. Mediterráneo.
108

,

420
424

.

Mitsuoka
T.

(

1995

)

Comparativa de ecología microbiana intestinal y el metabolismo en el hombre y en los animales

. En:

Médicos y Dentales Aspectos de Anaerobios

(

Duerden
B. I.

Wade
W. G.

Brasero
J. S.

Eley
A.

Wren
B.

Hudson
M. J

, Eds.), pp.

87
107

.

Revisiones científicas

.

Harmsen
H. J. M.

Wildeboer-Veloo
A. C. M.

Raangs
G. C.

et al. (

2000

)

Análisis del desarrollo de la flora intestinal en lactantes y lactantes alimentados con leche artificial mediante métodos de identificación y detección molecular

.

J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr.
30

,

61
67

.

Salminen
S.

Bouley
C.

Boutron-Ruault
M.-C.

et al. (

1998

)

Ciencia funcional de los alimentos y fisiología y función gastrointestinal

.

Br. J. Nutr.
80

,

S147
S171

.

Harmsen
H. J. M.

Gibson
G. R.

et al. (

1999

)

Comparación de recuentos celulares viables e hibridación fluorescente in situ utilizando sondas específicas basadas en ARNr para la cuantificación de bacterias fecales humanas

.

FEMS Microbiol. Lett.
183

,

125
129

.

Macfarlane
G. T.

Gibson
G. R.

Macfarlane
S.

(

1994

)

Producción de ácido graso de cadena corta y lactato por bacterias intestinales humanas cultivadas en cultivo continuo y por lotes

. En:

Ácidos Grasos de Cadena Corta

(

Cuaderno
H. J.

Cummings
J. H.

Soergel
K. H.

, Eds.), pp.

44
60

.

Kluwer Publishing

,

London

.

Allison
C.

McFarlan
C.

Macfarlane
G. T.

(

1989

)

Estudios sobre la mezcla de poblaciones de humanos intestinal las bacterias que crecen en único y de múltiples etapas continua de los sistemas de cultivo

.

Appl. Aprox. Microbiol.
55

,

679
683

.

Marsh
P.

(

1995

)

el papel de La cultura continua en la modelización de la microflora humana

.

J. Chem. Tecnología. Biotechnol.
64

,

1
9

.

Veilleux
B. G.

Rowland
I.

(

1981

)

Simulación de la rata ecosistema intestinal mediante dos etapas cultura continua del sistema

.

J. Gén. Microbiol.
123

,

103
115

.

Macfarlane
G. T.

Macfarlane
S.

Gibson
G. R.

(

1998

)

la Validación de tres etapas, compuesto continuo sistema de cultivo para la investigación del efecto del tiempo de retención en la ecología y el metabolismo de las bacterias en el colon humano

.

Microb. Ecol.
35

,

180
187

.

Edwards
C. A.

Parrett
A. M.

Balmer
SE

Wharton
B. A.

(

1994

)

Fecal de ácidos grasos de cadena corta en el pecho y los bebés alimentados con fórmula

.

Acta Paediatr.
83

,

459
462

.

Cummings
J. H.

(

1983

)

la Fermentación en el humano, intestino grueso: Evidencias e implicaciones para la salud

.

Lancet
1

,

1206
1208

.

Midtvedt
T.

Carlstedt-Duque
B.

Høverstad
T.

et al. (

1986

)

Influencia de los antimicrobianos perorales sobre la actividad biotransformadora de la microflora intestinal en sujetos sanos

.

Eur. J. Blink. Invertir.
16

,

11
17

.

Kawakami
H.

(

1997

)

Biological significance of sialic acid-containing substances in milk and their application

.

Recent Res. Dev. Agric. Biol. Chem.
1

,

193

207

.

Idota
T.

Kawakami
H.

Nakajima
I.

(

1994

)

Growth-promoting effects of N-actelylneuraminic acid containing substances on bifidobacteria

.

Biosci. Biotechnol. Biochem.
58

,

1720
1722

.

Bouhallab
S.

Favrot
C.

Maubois
J. L.

(

1993

)

actividad promotora del Crecimiento de la digestión tríptica de caseinomacropeptide por Lactococcus lactis ssp. lactis

.

Leche
73

,

73
77

.

Xue
Y.

Lui
J. N.

el Sol
Z.

Mate
Z.

Wu
C.

Zhu
D.

(

2001

)

alfa-Lactoalbúmina mutante actuando como la lisozima

. Estructura de proteínas

. Funt. Genet.
42

,

17
22

.

Pihlanto-Lappälä
A.

Marnila
P.

Hubert
L.

Rokka
T.

Korhonen
H. J. T.

El
M.

(

1999

)

El efecto de la alfa-lactoalbúmina y beta-lactoalbúmina hydrosylates en la actividad metabólica de Escherichia coli JM103

.

J. Appl. Microbiol.
87

,

540
545

.

Petschow
B. W.

Talbott
D.

(

1991

)

Respuesta de las especies de Bifidobacterium a promotores de crecimiento en humanos y de la leche de vaca

.

Pediatr. Res.
29

,

208
213

.

Francos
A. H.

Harmsen
H. J. M.

Raangs
G. C.

et al. (

1998

)

Variaciones de poblaciones bacterianas en heces humanas medidas mediante hibridación fluorescente in situ con sondas de oligonucleótidos dirigidas a ARNr 16S específicas de grupo

.

Appl. Aprox. Microbiol.
64

,

3336
3345

.

Neeser
J. R.

Golliard
M.

Woltz
A.

Rouvet
M.

Dillmann
M. L.

Guggenheim
B.

(

1994

)

In vitro modulador de la oral, la adhesión bacteriana a la saliva recubierto con hydroxypatite cuentas por parte de la caseína de la leche y derivados

. Microbiol oral. Inmunol.

9

,

193
201

.

Mundo
A. E.

Adlerberth
I.

(

2000

)

la lactancia Materna y la microflora intestinal de los lactantes con implicaciones para la protección contra las enfermedades infecciosas

. En:

Efectos a corto y Largo Plazo de la lactancia Materna en la Salud del niño

(

Keletzo
B.

et al. , Eréctil.).

Kluwer Academic/Plenum Publishers

,

New York

.

Pelligrini
A.

Thomas
U.

Bramaz
N.

Hunziker
P.

von Fellenberg
R.

(

1999

)

el Aislamiento y la identificación de tres bactericida de los dominios en la encefalopatía alfa-lactoalbúmina molécula

.

Biochim. Biophys. Acta
1426

,

439
448

.

Siigur
U.

Ormission
A.

Tamm
A.

(

1993

)

Ácidos grasos fecales de cadena corta en lactantes y lactantes alimentados con biberón

.

Acta Paediatr.
82

,

536
538

.

Wolin
M. J.

Yerry
S.

Miller
T. L.

Zhang
Y.

Banco
S.

(

1998

)

Cambios en la producción de etanol, ácidos y H2 a partir de glucosa por parte de la flora fecal de los lactantes de 16 a 158 días de edad

.

J. Nutr.
128

,

85
90

.

Rasic
J. L.

Kurmann
J. A.

(

1983

)

las Bifidobacterias y Su Papel

.

Birkhauser Verlag

,

Basel

.

el tianan
J.

Savaiano
D. A.

(

1997

)

Edición de fermentación colónica por las bifidobacterias y pH in vitro

.

Dig. Diez. Sci.
42

,

2370
2377

.

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