Verwendung einer Chargenkultur und eines zweistufigen kontinuierlichen Kultursystems zur Untersuchung der Wirkung von zusätzlichem α-Lactalbumin und Glycomakropeptid auf gemischte Populationen menschlicher Darmbakterien

Zusammenfassung

Bestimmte Milchfaktoren können das Wachstum einer wirtsfreundlichen gastrointestinalen Mikroflora fördern. Dies könnte erklären, warum gestillte Säuglinge weniger Darminfektionen erleiden als ihre mit der Formel gefütterten Gegenstücke. Die Wirkung der Nahrungsergänzung mit zwei solchen Faktoren wurde in dieser Studie untersucht. Säuglingskotproben wurden verwendet, um mit Glycomakropeptid und α-Lactalbumin ergänzte Formeln in einem zweistufigen kontinuierlichen Kulturmodell zu fermentieren. Die Bakteriologie wurde durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung bestimmt. Gefäße, die Muttermilch sowie α-Lactalbumin und Glycomakropeptid enthielten, wiesen stabile Bifidobakterienzahlen auf, während Laktobazillen nur in Gefäßen mit Muttermilch signifikant anstiegen. Bacteroides, Clostridien und Escherichia coli nahmen in allen Läufen signifikant ab. Acetat war die Hauptsäure, die zusammen mit hohen Mengen an Propionat und Lactat gefunden wurde. Die Ergänzung von Säuglingsanfangsnahrung mit geeigneten Milchproteinen kann nützlich sein, um die vorteilhaften bakteriologischen Wirkungen von Muttermilch zu simulieren.

1 Einleitung

Der menschliche Dickdarm ist ein komplexes Ökosystem, in dem eine Vielzahl von Bakterien leben. Es wird angenommen, dass mindestens 400 verschiedene Bakterienarten gleichzeitig vorhanden sind, wobei bis zu 1012 Bakterien pro g Kot gefunden werden . Die Mikroflora wird bei der Geburt erworben, wobei das sterile Neugeborene während des Entbindungsprozesses von verschiedenen Bakterien besiedelt wird . In den ersten Lebenstagen überwiegen ernährungsphysiologisch anspruchslose Prokaryoten wie Enterobakterien, Staphylokokken und Streptokokken (einschließlich Enterokokken). Innerhalb der ersten Lebenswoche etablieren sich Gattungen wie Bifidobakterien und Bacteroides . Es wird angenommen, dass gestillte Säuglinge eine Dickdarmflora haben, die numerisch von Bifidobakterien dominiert wird, während diejenigen, die mit der Formel gefüttert werden, komplexere Mikrobiota haben, die in ihrer Zusammensetzung denen von Erwachsenen ähnlich sind . Bifidobakterien können starke antimikrobielle Wirkungen gegen eine Vielzahl von Darmpathogenen wie bestimmte Enterobacteriaceae und Clostridium spp. Daher wird ein Vorherrschen von Bifidobakterien als ein Indikator für eine verbesserte Darmgesundheit angesehen . Beobachtungen zur normalen Darmflora wurden weitgehend aus quantitativer Plattenkultur und phänotypischer Charakterisierung abgeleitet, die hinsichtlich der Wiederherstellungseffizienz und der Subjektivität des Bedieners Einschränkungen aufweisen .Da der proximale Dickdarm für Routinezwecke physikalisch unzugänglich ist, wurden die meisten mikrobiellen Studien zur Fermentation mit Fäkalbakterien entweder in Chargenkultur oder in einstufigen Chemostaten durchgeführt . Die Chargenkultur ermöglicht die Bestimmung der Fermentationsfähigkeit verschiedener Substrate über kurze Zeiträume (24 h). Es bestehen jedoch deutliche Unterschiede in der Substratverfügbarkeit und den Umgebungsbedingungen zwischen dem proximalen und distalen Dickdarm, die in einem einzigen Gefäßsystem nicht simuliert werden können .Im Gegensatz dazu haben In-vitro-Systeme, die mehrere in Reihe geschaltete Fermentationsgefäße verwenden, Vorteile, da sie komplexere Umweltbedingungen modellieren und gleichzeitig räumliche und zeitliche Heterogenität zulassen können . Beispielsweise zeigte ein zweistufiger Chemostat mit Zellrecycling von der zweiten zur ersten Stufe zufriedenstellende Ergebnisse . Eine weitere Verfeinerung zur Modellierung des adulten menschlichen Dickdarms wurde von Macfarlane et al. unter Verwendung eines dreistufigen verbundkontinuierlichen Kultursystems. Dies wurde mikrobiologisch gegen menschliches Kolonmaterial validiert, das von Opfern des plötzlichen Todes bei der Autopsie erhalten wurde. Solche Modelle sind wertvoll für die Untersuchung der Darmflora, da verschiedene physikalisch-chemische Bedingungen kontrolliert werden können. Dies hat klare wirtschaftliche Vorteile, ist aber vor allem für die Planung von Humanstudien relevant.

Unterschiede in der Fäkalflora spiegeln sich auch in unterschiedlichen Laktat-, Kurz- (SCFA) und verzweigtkettigen Fettsäuremustern wider, die Zwischen- und Endprodukte der bakteriellen Fermentation sind . Ihre Produktionsrate und ihr Fermentationsmuster können auch durch die Substratverfügbarkeit für die Darmbakterienflora bestimmt werden . Daher können Veränderungen in der Fäkalflora aufgrund einer Ernährungsumstellung oder einer antimikrobiellen Therapie auch zu einer Änderung der Fermentationsmuster und der Konzentration organischer Säuren führen . Die Menge solcher Säuren, die beim Menschen produziert werden, ist schwer zu bestimmen, und es wurden nur wenige Studien durchgeführt, die darauf hindeuten, dass bei Erwachsenen täglich zwischen 300 mmol und 1-2 mol Säure produziert werden. Es wurde festgestellt, dass Acetat in allen Fällen der Haupt-SCFA ist, und es gibt Hinweise darauf, dass die SCFA-Konzentrationen im Blinddarm ungefähr doppelt so hoch sind wie im recto-sigmoiden Bereich .

Es wurde bereits gezeigt, dass zwei Milchkomponenten in vitro gastrointestinale Infektionen hemmen und / oder Bifidobakterien stimulieren. Glycomakropeptid (GMP), ein Derivat von κ-Casein, wurde in vitro umfassend untersucht und hemmt nachweislich die Adhäsion von Bakterien, Viren und Toxinen an die Zellmembran durch Bindung an die Rezeptorstellen des Pathogens . Diese In-vitro-Assays zeigten auch, dass GMP das Wachstum von Bifidobacterium breve, B. bifidum, B. infantis und Lactococcus lactis stark förderte. es wurde gezeigt, dass α-Lactalbumin (α-la), das eine Tertiärstruktur aufweist, die mit Lysozymen vom c-Typ vergleichbar ist, ähnliche Wirkungen hat . Pihlanto-Leppälä et al. zuvor zeigte, dass α-la die metabolische Aktivität von Escherichia coli JM103 auf nur 21% des Normalwerts senkte. Zusätzlich zeigte die Prüfung der gereinigten Kuhmilch, dass α-la ein starker Wachstumsförderer für B. infantis und B. breve war.

In dieser Studie verwendeten wir Batch-Kultur und ein zweistufiges verbundkontinuierliches Kultursystem, um Fermentationseigenschaften und bakterielle Aktivitäten nach Ergänzung von Säuglingsnahrung mit α-la und GMP zu testen. Das kontinuierliche Kultursystem wurde aus dem von Macfarlane et al. . Sein kleineres Betriebsvolumen und schnellere Fluktuationsraten versuchten, die physikalischen Faktoren zu berücksichtigen, die bei menschlichen Säuglingen gefunden wurden. Wir haben getestet, ob die Supplementierung von α-la und GMP die Magen-Darm-Flora verändern kann, um ähnliche Vorteile wie bei gestillten Säuglingen zu erzielen.

2 Materialien und Methoden

2.1 Batchkultur

Für die anaeroben Batchkultursysteme enthielt das basale Kulturmedium (pro Liter): 1 g Pepton, 1 g Hefeextrakt, 0,05 g NaCl, 0,02 g K2HPO4, 0,02 g KH2PO4, 0,005 g MgSO4·7H2O, 0,005 g CaCl2·6H2O, 1 g NaHCO3, 1 ml Zwischen 80, 0.0025 g Haemin, 5 µl Vitamin K1, 0,25 g Cystein HCl und 0,25 g Gallensalze gelöst in 500 ml entionisiertem Wasser, auf pH 7,0 eingestellt und autoklavierbar sterilisiert. Alle Chemikalien wurden von Sigma (Poole, Dorset, UK) bezogen, sofern nicht anders angegeben. Steriles Medium (50 ml) wurde in 100-ml-Batch-Kulturflaschen gefüllt, die 0,5 g (1% w / v) einer Testformel (Arla Foods Ingredients, Viby, Dänemark) enthielten, die entweder mit α-la (68% w / v) oder GMP (80% w / v) ergänzt wurde % w / v) und unter einer Atmosphäre von sauerstofffreiem Stickstoffgas gehalten. Die Formeln wurden mit einem Standard verglichen, der 1% (w/w) Lactose enthielt. Am nächsten Tag wurde eine frische Kotprobe in einem Magenbeutel gesammelt und sofort verarbeitet. Das Experiment wurde fünfmal mit fünf verschiedenen Spendern wiederholt.

Die Batch-Kulturgefäße wurden mit 5 ml einer 10% igen (w / v) Fäkalaufschlämmung von gesunden erwachsenen Freiwilligen inokuliert, die mit anaerober phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 0,1 M, pH 7,2) hergestellt wurden, und 1-ml-Proben wurden zu Zeiten 0 (vor dem Einbringen der Probe in die Batch-Kultur), 6 h und 24 h entnommen und bis zur weiteren Verwendung bei 4 ° C gelagert. Zur Zählung von Bakterien durch fluoreszierende in situ Hybridisierung (FISH) wurden 375 µl Triplikate der gesammelten Probe entnommen und in ein 1,5ml Eppendorf Röhrchen mit 1125 µl filtersterilisiertem 4% (w/v) Paraformaldehyd in PBS (pH 7,2) gegeben und für mindestens 4 h bei 4°C fixiert. Die fixierte Probe wurde dann für 5 min bei 13 000×g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml filtriertem PBS (pH 7,4) mit 0,00001% (w/v) Cetyltrimethylammoniumbromid resuspendiert und in ein Eppendorf-Röhrchen zur Repelletierung überführt (13 000×g, 5 min). Nach zweitem Waschen des Pellets wurde der Überstand entfernt und das Pellet in 150 µl filtriertem PBS und 150 µl 96%(v/v) Ethanol gründlich resuspendiert. Die Probe wurde gut gemischt und vor der Hybridisierung mit einer Fluoreszenzsonde (wie unten beschrieben) mindestens 1 h bei -20°C gelagert.

2.2 Zweistufiges kontinuierliches Kultursystem

Das kontinuierliche Kultursystem bestand aus zwei Glasgefäßen, V1 und V2, beide mit einem Arbeitsvolumen von 100 ml. Temperatur (37°C) und pH-Wert wurden automatisch geregelt. Der pH-Wert in den Gefäßen betrug 5.2 in V1, was die Umgebung mit niedrigem pH-Wert des proximalen Dickdarms darstellt, und 6,5 in V2, was auf einen neutraleren pH-Wert im distalen Dickdarm hinweist. Jeder Fermenter wurde magnetisch gerührt und das Wachstumsmedium kontinuierlich mit sauerstofffreiem Stickstoff (15 ml min-1) versetzt und aus einem Glasmediumreservoir durch eine Peristaltikpumpe (Watson−Marlow, Falmouth, UK) nach V1 geleitet. V1 sequentiell versorgt V2 über einen Überlauf und eine Reihe von Wehren. Der Überlauf von V2 wurde zu einem Abfallbehälter geführt. Das Kulturmedium bestand aus (A) dem oben beschriebenen Basalmedium mit 1% (w/v) zugesetzter Lactose (Sigma, Poole, Dorset, UK), (B) menschlicher Muttermilch (bereitgestellt von Royal Berkshire Hospital, Reading, UK) mit 0,5 g l−1l-Cystein-HCl zugesetzt, (C) Testformel mit 68% (w/v) zusätzlichem α-la, 1% (w/v) Lactose und 0,5 g l−1l-Cystein-HCl und (D) Testformel mit 68% (w/v) GMP, 1% (w/v) Lactose und 0,5 g l−1l-Cystein-HCl. Alle Formeln wurden von Arla Foods Ingredients (Viby, Dänemark) erhalten und mit Pepsin (575 U pro g Protein) bei pH 2 für 2 h (37 ° C) vorverdaut, gefolgt von Pankreatin (50 U pro g Protein) und 0,5 g l−1 Volumen Gallensäure bei pH 6,5 für zwei h (37 ° C). Zur Sicherstellung der Anaerobizität wurden 4 ml l−1 einer 250 mg l−1 Stammlösung von Resazurin gekocht und dem Medium zugesetzt. Anschließend wurden die Medien 20 min auf 80°C erhitzt, über Nacht auf Raumtemperatur abgekühlt und weitere 20 min auf 80°C erhitzt, bevor sie kontinuierlich mit O 2-freiem N 2 begast wurden. Das System wurde mit einer Retentionszeit (R) von 12 h, berechnet als Kehrwert der Verdünnungsrate, betrieben. Die Systemretentionszeit ist die Summe der einzelnen R-Werte in jedem Fermenter. Jeder Fermenter wurde mit 15 ml einer frischen 10% igen (w / v) Fäkalaufschlämmung von gesunden Säuglingsspendern im Alter zwischen 1 und 6 Monaten inokuliert und mit Muttermilch mit Ergänzungsnahrung gefüttert. Die Aufschlämmung wurde unter Verwendung von anaerobem 0,1 M PBS (pH 7,2) hergestellt. Alle Experimente wurden fünfmal mit verschiedenen Spendern wiederholt, mit Ausnahme der Gruppe B (Muttermilch), wo das Experiment einmal mit dem Fäkalmaterial eines 3 Monate alten, ausschließlich gestillten Spenders durchgeführt wurde. Die Gruppen C und D enthielten jeweils fünf verschiedene Individuen. Proben wurden nach dem Alter von 1, 3 und 6 Monaten entnommen, um Unterschiede in der fäkalen Mikroflora und Veränderungen der Wirksamkeit von Nahrungsergänzungsmitteln mit zunehmendem Alter der Säuglinge zu beurteilen. Das Fermentationssystem wurde über Nacht äquilibriert, bevor die Mediumpumpe gestartet wurde, und wurde mindestens 144 h lang betrieben, um Steady-State-Bedingungen herzustellen. 3-ml-Proben des ursprünglichen Inokulums (N) wurden nach Equilibrierung (T0) und unter Steady-State-Bedingungen (TS) entnommen und wie oben beschrieben für die FISH-Analyse vorbereitet.

2.3 Bakterielle Aufzählung durch FISCHE

Oligonukleotidsonden (Tabelle 1) für Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp./Enterococcus, Bacteroides spp. , Clostridium histolyticum-Gruppe und E. coli wurden synthetisiert und am 5′-Ende mit Cy3 (Ex 552 nm, Em 568 nm) entweder von Eurogentec (Abingdon, UK) oder MWG-Biotech (Milton Keynes, UK) monomarkiert. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 50°C für Bifidobacterium und Clostridium, bei 45°C für Lactobacillus und Bacteroides und bei 37°C für E. coli. Zur Hybridisierung wurden 200 µl filtrierter Puffer (40 mM Tris–HCl pH 7,2, 1,8 M NaCl) enthaltend 20 ml l−1 10% (w/v) SDS und 64 µl HPLC-Wasser zu 16 µl fixierten Zellen gegeben und auf die entsprechende Temperatur erwärmt. Zu 10 µl der entsprechenden Sonde (Endkonzentration 50 ng µl−1) wurde vorgewärmte Hybridisierungslösung (90 µl) gegeben und die Lösung über Nacht in einem Hybridisierungsofen inkubiert. Für die E. coli-Sonde wurden 264 µl Hybridisierungspuffer mit 35% (v/v) Formamid zu 16 µl fixierten Zellen gegeben. Die Zellen wurden durch Zugabe von 5 ml Waschpuffer (20 mM Tris–HCl pH 7,2, 0,9 M NaCl) zu 5-100 µl hybridisierter Probe gewaschen, mit 20 µl 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, Ex 344, Em 450; 500 ng ml−1) angefärbt und 30 min in einem Hybridisierungsofen inkubiert. Für die Gesamtzählungen wurden 5-12 µl Probe auf einen 0,2 µm Porengrößenpolycarbonatfilter (Millipore, Watford, UK) vakuumfiltriert und auf einen Objektträger gegeben. Um ein Verblassen der Sonden zu vermeiden, wurde ein Tropfen des SlowFade-Light Antifade Kit Komponente A (Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande) in den Filter gegeben. Objektträger wurden mit einem EPI-Fluoreszenz-Aufsatz (Nikon UK, Kingston upon Thames, UK) mikroskopisch untersucht. UV-Licht wurde verwendet, um DAPI-gefärbte Bakterien zu zählen, und Cy3-gefärbte Zellen wurden bei 550 nm aufgezählt. Fünfzehn zufällige Felder mit einer guten Verteilung der Zellen (10-100) wurden für jede Sonde und Probe gezählt.

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Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

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Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

2.4 Volatile acid analysis

Undiluted aliquots (1.0 ml) Probe wurden in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen abgefüllt und zentrifugiert (13 000×g, 5 min), um Bakterien und andere Feststoffe zu pelletieren. Der Überstand wurde dann mit einem 0,2 µm Polycarbonatfilter filtriert und zu vier Teilen Acetonitril gegeben, das 4,3 mmol l−1 2-Ethylbuttersäure als internen Standard enthielt. Die Kalibrierung erfolgte mit Standardlösungen von Essigsäure, Propionsäure, i-Buttersäure, n-Buttersäure, i-Valeriansäure, n-Valeriansäure, n-Capronsäure und dl-Milchsäure in Acetonitril. Fettsäuren wurden mittels Gas–Flüssigkeits-Chromatographie an einem GC-System der Agilent 6890-Serie (Agilent, Waldbronn, Deutschland) bestimmt, das mit einer Optima FFAP-Säule (25 m × 0,32 mm, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) und einem Flammenionisationsdetektor ausgestattet war. Das Trägergas Helium wurde mit einer Flussrate von 1,8 ml min−1 gefördert. Injektor, Säule und Detektor wurden auf 220°C, 140°C (isotherm) bzw. 220°C eingestellt. Nach 5 min wurde die Säulentemperatur in Schritten von 20°C min−1 auf 240°C erhöht, um weitere 15 min zu laufen. Die Peaks wurden über einen PC mit Atlas Lab Management Software (Thermo Lab Systems, Mainz, Deutschland) integriert. Die Fettsäurekonzentrationen wurden durch Vergleich ihrer Peakflächen mit denen des internen Standards berechnet und in Millimol pro Liter ausgedrückt.

2.5 Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde unter Verwendung einer Einweg-ANOVA (Inokulum versus Steady-State, TS) zur Bestimmung der Signifikanz bei P<0.05 durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

3 Ergebnisse

3.1 Chargenkultur

Vor der Inokulation enthielten Proben nahezu identische Anzahlen von Bifidobacterium spp., Bacteroides spp., und Clostridium spp. Laktobazillen waren weniger zahlreich. In Kulturen, die α-la enthalten (Abb. 1), Gesamtzahl, Bifidobakterien, Clostridien, Laktobazillen und Bacteroides blieben unverändert. Die Anzahl der E. coli nahm signifikant ab (P <0,01) mit α-la-Supplementierung nach 6 h Inkubation, stieg jedoch wieder auf Ausgangswerte an (nicht gezeigt).

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Mittlere Bakterienzahl (log10) in adulten fäkalen Inokulumen und Batchkulturen, die basales Medium mit 1% (w/w) Lactose oder 1% (w/w) Testformel enthalten. Die Ergebnisse sind Mittelwerte (log10 pro g Nassgewicht)±SDN=fäkales Inokulum; 24 h, Lactose= Kultur nach 24 h Inkubation mit Lactose; 24 h, a-la / GMP= Kultur nach 24 h Inkubation mit α-la oder GMP.

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Mittlere Keimzahlen (log10) in adulten fäkalen Inokulumen und Batchkulturen, die Basalmedium mit 1% (w/w) Lactose) oder 1% (w/w) Testformel enthalten. Die Ergebnisse sind Mittelwerte (log10 pro g Nassgewicht)±SDN=fäkales Inokulum; 24 h, Lactose= Kultur nach 24 h Inkubation mit Lactose; 24 h, a-la / GMP= Kultur nach 24 h Inkubation mit α-la oder GMP.

Kulturen, die GMP enthalten (Abb. 1) allgemein gehaltene Anzahl von Bifidobakterien, Bacteroides, Laktobazillen und Clostridien. Die Anzahl der E. coli nahm nach 6 h Inkubation signifikant ab (P<0,05), stieg jedoch wieder auf Basalwerte an (nicht gezeigt).

3.2 Zweistufiges Verbundkontinuierliches Kultursystem

In Gefäßen mit dem gleichen Standardmedium (Basalmedium mit 1 Gew.-% Lactose, Abb. 2) blieben die Gesamtkeimzahlen, Bifidobakterien, Laktobazillen und Clostridien konstant. Im Gegensatz dazu nahmen Bacteroides in beiden Fermentationsgefäßen nach dem Gleichgewicht signifikant zu und blieben im Steady State in beiden Gefäßen höher als die Inokulumspiegel (P<0,05). Eine statistisch signifikante Abnahme (P<0,05) konnte für E. coli in Gefäß 2 (pH 6,5) nach Equilibrierung beobachtet werden. Dies wurde jedoch nicht aufrechterhalten und beide Gefäße wiesen im Steady State vergleichbare E. coli-Spiegel auf, die niedriger waren als das Inokulum.

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Mittlere Keimzahlen (log10) in fäkalen Inokulum- und Kontrollfermentergefäßen mit basalem Medium, das 1% (w/ w) Lactose oder Muttermilch (BM) enthält. Die Ergebnisse sind Mittelwerte (log10 pro g Nassgewicht) ±SDN =fäkales Inokulum; V1TS = Gefäß 1 im Steady State (pH 5,2); V2TS = Gefäß 2 im Steady State (pH 6,5).

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Mittlere Keimzahlen (log10) in fäkalen Inokulum- und Kontrollfermentergefäßen mit basalem Medium, das 1% (w/w) Lactose oder Muttermilch (BM) enthält. Die Ergebnisse sind Mittelwerte (log10 pro g Nassgewicht) ±SDN =fäkales Inokulum; V1TS = Gefäß 1 im Steady State (pH 5,2); V2TS = Gefäß 2 im Steady State (pH 6,5).

Nach den Gefäßen mit Muttermilch (Abb. 2) 24 h äquilibrieren gelassen, wurde ein statistisch signifikanter Anstieg (P<0,05) für Laktobazillen in Gefäß 2 (pH 6) beobachtet.5), die bis zum Erreichen des Steady State beibehalten wurde. Die Anzahl der Bifidobakterien blieb stabil. Im Gegensatz dazu nahmen die Clostridien in beiden Gefäßen signifikant ab (P<0,01) und verschwanden im Steady State vollständig aus Gefäß 1 (pH 5,2). Ähnliche Abnahmen (P<0,05) wurden für E. coli in Gefäß 1 (pH 5,2), nicht jedoch in Gefäß 2 (pH 6,5) beobachtet. Gefäße, die α-la enthielten und mit Fäkalproben von 1- und 3-monatigen Säuglingen inokuliert waren, wiesen stabile Gesamtzahlen sowie Spiegel anderer Bakterien auf (nicht gezeigt). Wenn die Fermenter mit Fäkalproben von 6 Monate alten Säuglingen inokuliert wurden (Abb. 3), die Gesamtzahl und die Anzahl der Laktobazillen blieben unverändert. Die Anzahl der Bacteroide, Clostridien und E. coli nahm nach Equilibrierung merklich ab und es wurde eine statistisch signifikante Reduktion (P<0,05) bei beiden pH-Werten beobachtet. Gefäße, die GMP enthielten und mit Stuhlproben von 1- und 3-monatigen Säuglingen inokuliert waren, wiesen Gesamtzahlen, Bacteroide und E. coli auf, die schwankten, aber stabil blieben. Wie bei α-la beobachtet, zeigten Laktobazillen im Vergleich zu den Ausgangsproben einen leichten Aufwärtstrend, es wurde jedoch keine statistische Signifikanz beobachtet (nicht gezeigt). Wenn die Fermenter mit Fäkalien von 6 Monate alten Säuglingen inokuliert wurden (Abb. 3), Gesamtzahl, Laktobazillen und Bifidobakterien blieben unverändert. Die Anzahl der Bacteroide, Clostridien und E. coli nahm nach dem Gleichgewicht merklich ab, und bei beiden pH-Werten wurde eine statistisch signifikante Reduktion (P <0, 05) beobachtet, ähnlich wie bei α-la-supplementierter Formel.

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Mittlere Bakterienzahlen in Inokulum- und Fermentergefäßen (log10), die α-la oder GMP enthalten, unter Verwendung von Fäzes von 6 Monate alten Spendern. Die Ergebnisse sind Mittelwerte (log10 pro g Nassgewicht) ±SDN =fäkales Inokulum; V1TS = Gefäß 1 im Steady State (pH 5,2); V2TS = Gefäß 2 im Steady State (pH 6,5).

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Mittlere Keimzahlen in Inokulum- und Fermentergefäßen (log10), die α-la oder GMP enthalten, unter Verwendung von Fäzes von 6 Monate alten Spendern. Die Ergebnisse sind Mittelwerte (log10 pro g Nassgewicht) ± SDN = fäkales Inokulum; V1TS = Gefäß 1 im Steady State (pH 5,2); V2TS=Gefäß 2 im Steady State (pH 6,5).

3,3 Organische Säuren

Die Gesamtmengen an organischen Säuren variierten statistisch signifikant (P<0,05) zwischen der Inokula und der Probe, wobei die mittlere Gesamtsäure für die Inokula 4,28 mmol l−1, 8,16 mmol l−1 und 15,64 mmol l−1 im Vergleich zu 73,80 mmol/l−1 18, 93-160, 49), 39, 29 mmol l–1 (Bereich 15, 30-100, 28) und 80, 49 mmol l−1 (Bereich 28, 07-177, 34) für 1–, 3− und 6–Monate alte Spender. Standardfehler waren 4.96%, 3.10%, 2.61%, 1.80%, 0.91%, 0.84%, 1.91% und 5.12% für Acetat, Propionat, i-Butyrat, n-Butyrat, i-Valerat, n-Valerat, Caproat bzw. Acetat war in allen Gruppen die vorherrschende Säure (Abb. 4) gefolgt von Lactat und Propionat mit durchschnittlich 63%, 21%, 11% der Gesamtsäure. d(-)-Lactat wurde überwiegend im Vergleich zu l(+)-Lactat gefunden, das nur sporadisch und in minimalen Mengen vorkam. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Studiengruppen für Isosäuren, Valerat und Caproat gefunden, die in Spuren auftraten.

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Mittlere relative Mengen (%) Säure in Fermentergefäßen. Diäten: N = Inokulum; a-la (α-la) = α-Lactalbumin; GMP = Glycomakropeptid; BM = Muttermilch. Spenderalter: 1 = 1 Monat; 3 = 3 Monate; 6 = 6 Monate nach der Geburt.

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Mittlere relative Mengen (%) Säure in Fermentergefäßen. Diäten: N = Inokulum; a-la (α-la) = α-Lactalbumin; GMP = Glycomakropeptid; BM = Muttermilch. Spenderalter: 1 = 1 Monat; 3 = 3 Monate; 6 = 6 Monate nach der Geburt.

Es gab jedoch einen statistisch signifikanten Unterschied (P<0.05) zwischen den Gruppen für die relativen Mengen der Hauptsäuren und n-Butyrat. Acetat und Lactat traten im Allgemeinen im Verhältnis 3:2 auf, mit Ausnahme des Inokulums von 6 Monate alten Säuglingen, bei denen Lactat vorherrschte (P<0, 01). die n-Butyratkonzentrationen nahmen im Allgemeinen mit dem Spenderalter zu, während Propionat abnahm, bis beide ungefähr gleich konzentriert waren. Geringe Mengen an i-Butyrat wurden auch in allen Spenderaltersgruppen sowie in der Muttermilchgruppe gefunden.

4 Diskussion

Basierend auf früheren Studien wird allgemein angenommen, dass gestillte Säuglinge von Mikrobiota profitieren können, die numerisch von Bifidobakterien und / oder Laktobazillen dominiert werden . α-La und GMP wurden zuvor gefunden, um ausgewählte Reinkulturen von Bifidobakterien in vitro signifikant zu stimulieren. Ähnliche Ergebnisse wurden jedoch hier in der Mischkultur nicht gesehen. In vorläufigen Chargenkulturen, die mit adultem Fäkalmaterial inokuliert wurden, wurde kein statistisch signifikanter Effekt auf die nützliche Mikroflora beobachtet. Das gleiche galt für beide Ergänzungen, wenn sie in kontinuierlicher Kultur verwendet wurden, die mit Fäkalmaterial von Säuglingen verschiedener Altersgruppen geimpft war. Trotzdem waren Bifidobakterien sowohl in den Testformeln als auch in der Muttermilchkontrolle die dominierende Gruppe, wobei Bifidobakterien auch während des gesamten Experiments konstant blieben. Eine tiefere Wirkung wurde für Laktobazillen beobachtet. Muttermilch erhöhte Laktobazillen signifikant. Ein geringfügiger, aber statistisch unbedeutender Anstieg der Laktobazillenwerte wurde mit GMP im Kot von 3 Monate alten Säuglingen gezeigt, ein Trend, der sich in Experimenten mit Stuhlmaterial von 6 Monate alten Säuglingen fortsetzte.

Es wird auch angenommen, dass beide Formelergänzungen eine gewisse hemmende Wirkung auf eine Vielzahl von Krankheitserregern haben. Es wurde zuvor gezeigt, dass GMP sowohl in seiner N-Acetylneuraminsäure (Sialinsäure) enthaltenden Kohlenhydratkette als auch in seinem Polypeptidanteil mehrere antipathogene Eigenschaften aufweist . Das Vorhandensein von Sialinsäuren auf der Oberfläche von Darmzellen ist häufig für die Infektion einer Vielzahl von magensaftresistenten Erregern erforderlich, und eine exogene GMP-Quelle kann die für die Infektion wesentliche bakterielle Adhäsion hemmen. Dies wurde von Kawakami durch Hemmung der Adhäsion enteropathogener E. coli an humane Darmzelllinien nachgewiesen. Im Allgemeinen ist die Konzentration an sialinsäurehaltigen Komponenten in der Muttermilch höher als in Säuglingsanfangsnahrung. Eine hemmende Wirkung von GMP auf Bacteroides, clostridia und E. coli, drei potenziell pathogene Organismen, wurde in dieser Studie beobachtet. Während in vorläufigen Chargenkulturen mit adultem Fäkalmaterial die Zählungen im Allgemeinen konserviert wurden, war in der kontinuierlichen Kultur ein Abwärtstrend zu beobachten. Eine statistisch signifikante Reduktion dieser Organismen wurde jedoch nur in Kulturen mit Fäkalmaterial von 6 Monate alten Säuglingen nachgewiesen. Ähnliche Ergebnisse wurden in der Muttermilch beobachtet, die Clostridien und E. coli signifikant verringerte, während Bacteroides unverändert blieb. Im Gegensatz dazu erhöhte das Basalmedium die Bacteroides-Spiegel signifikant, was zeigt, dass Veränderungen in der Zusammensetzung der Flora nicht auf das Auswaschen zurückzuführen waren, sondern vom Fermentationsmedium abhingen.α-La, eine regulatorische Komponente der Lactosesynthase, teilt eine hohe Sequenzidentität mit Lysozymen vom c-Typ und hat eine ähnliche dreidimensionale Struktur, was darauf hindeutet, dass sie von einem gemeinsamen Ahnengen stammen . Es wurden mehrere Studien durchgeführt, die darauf hindeuten, dass α-la ähnliche Wirkungen auf Krankheitserreger haben könnte . Im Gegensatz dazu Pelligrini et al. gefunden, dass proteolytische Verdauung durch Trypsin und Pepsin ergab drei Peptide mit bakteriziden Eigenschaften, meist aktiv gegen gramnegative Organismen. Bakteriostatische Eigenschaften von hydrolysiertem α-la wurden speziell für E. coli beobachtet. In dieser Studie wurde eine hemmende Wirkung von α-la auf Bacteroides, Clostridien und E. coli beobachtet. Auch hier wurde eine statistisch signifikante Reduktion dieser Organismen nur in Kulturen mit Stuhlmaterial von 6 Monate alten Säuglingen nachgewiesen, ein Ergebnis, das mit dem für Muttermilchkontrollen vergleichbar ist.Unsere Studie bestätigte, dass Acetat der Haupt-SCFA bei gestillten Säuglingen im Vergleich zu mit der Flasche gefütterten Säuglingen war, zusammen mit niedrigen Konzentrationen von Propionat und einer fast vollständigen Abwesenheit von Butyrat in den ersten 117 Lebenstagen . Lactat und Acetat traten im Allgemeinen im Verhältnis 2:3 auf, was die von Rasic und Kurmann beschriebene vorherrschende Rolle von Bifidobakterien in der Mikroflora bestätigt. Eine hohe Inzidenz von Laktat ist auch typisch für eine unvollständige oder schnelle Fermentation, die häufig mit einem sauren pH-Wert verbunden ist, wie er bei gestillten Babys beobachtet wird . Dies wurde hier jedoch nicht bestätigt, da das fäkale Inokulum gestillter Spenderinnen, die Muttermilch fermentierten, ein Säureprofil erzeugte, das fast vollständig frei von Laktat war. Auf der anderen Seite erzeugten Fäkalproben, die α-la- und GMP-supplementierte Formel fermentierten, ein für die Formelfermentation charakteristisches Säureprofil mit höheren Konzentrationen an n-Butyrat, die mit dem Alter des Spenders zunahmen . Acetat blieb jedoch weiterhin vorherrschend, wie es bei ausschließlich gestillten Säuglingen beobachtet wurde.

Zusammenfassend haben wir die mikrobiologischen Wirkungen der Supplementierung von Säuglingsanfangsnahrung mit α-la und GMP gezeigt. Im Vergleich zu früheren In-vitro-Studien mit Reinkulturen von Bifidobakterien wurde eine bifidogene Wirkung der beiden Supplemente bei Verwendung von Fäkalieninokula nicht beobachtet. Es wurde jedoch eine statistisch signifikante Reduktion der potentiell pathogenen Mikroflora beobachtet, die derjenigen bei gestillten Säuglingen ähnlich war. In diesem Zusammenhang kann daher der Schluss gezogen werden, dass eine α-la- und GMP-Supplementierung in Kombination mit hohen Acetatmengen positive Auswirkungen auf die menschliche Mikroflora hat.

Danksagung

Die Forscher möchten Frau Alethea Hill sowie den Spendern und ihren Eltern für ihre Unterstützung, ihren Enthusiasmus und ihre unschätzbare Hilfe für die Studie danken.

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