anvendelse af batchkultur og et totrins kontinuerligt kultursystem til undersøgelse af effekten af supplerende LARP-lactalbumin og glycomacropeptid på blandede populationer af humane tarmbakterier

abstrakt

visse mælkefaktorer kan fremme væksten af en værtsvenlig gastrointestinal mikroflora. Dette kan forklare, hvorfor ammede spædbørn oplever færre tarminfektioner end deres formel-fodrede modstykker. Effekten af formeltilskud med to sådanne faktorer blev undersøgt i denne undersøgelse. Spædbørns fækale prøver blev brugt til at fermentere formler suppleret med glycomacropeptid og Lars-lactalbumin i en to-trins sammensat kontinuerlig kulturmodel. Bakteriologi blev bestemt ved fluorescens in situ hybridisering. Fartøjer, der indeholdt modermælk såvel som kurr-lactalbumin og glycomacropeptid, havde stabile tællinger af bifidobakterier, mens lactobaciller kun steg signifikant i kar med modermælk. Bacteroides, clostridia og Escherichia coli faldt markant i alle kørsler. Acetat var den vigtigste syre fundet sammen med store mængder propionat og lactat. Tilskud af modermælkserstatninger med passende mælkeproteiner kan være nyttige til simulering af de gavnlige bakteriologiske virkninger af modermælk.

1 Introduktion

den menneskelige tyktarm er et komplekst økosystem med en lang række bakterier. Mindst 400 forskellige bakteriearter menes at være til stede på et hvilket som helst tidspunkt, med op til 1012 bakterier fundet pr . Mikrofloraen erhverves ved fødslen, hvor det sterile nyfødte bliver koloniseret af forskellige bakterier under leveringsprocessen . I løbet af de første par dage af livet dominerer ernæringsmæssigt krævende prokaryoter såsom enterobakterier, stafylokokker og streptokokker (inklusive enterokokker). Inden for den første uge af livet etableres slægter som bifidobakterier og Bacteroides . Det antages, at ammede spædbørn har en kolonflora, der er numerisk domineret af bifidobakterier, mens de, der fodres med formel, har mere kompleks mikrobiota, der ligner sammensætningen hos voksne . Bifidobakterier kan udøve kraftige antimikrobielle virkninger mod en række tarmpatogener, såsom visse Enterobacteriaceae og Clostridium spp. Som sådan ses en overvægt af bifidobakterier som en indikator for forbedret tarmsundhed . Observationer af den normale tarmmikroflora er i vid udstrækning afledt af kvantitativ pladekultur og fænotypisk karakterisering, som har begrænsninger med hensyn til genvindingseffektivitet og operatørens subjektivitet .da den proksimale kolon er fysisk utilgængelig til rutinemæssige formål, er størstedelen af mikrobielle undersøgelser af fermentering desuden blevet udført med fækale bakterier i enten batchkultur eller kemostater i et trin . Batchkultur muliggør bestemmelse af fermenterbarheden af forskellige substrater i korte perioder (24 timer). Der findes imidlertid markante forskelle i substrattilgængelighed og miljøforhold mellem den proksimale og distale kolon, som ikke kan simuleres i et enkelt karsystem .i modsætning hertil har in vitro-systemer, der bruger flere fermenteringsbeholdere, der er justeret i serie, fordele ved at være i stand til at modellere mere komplekse miljøforhold, samtidig med at de muliggør rumlig og tidsmæssig heterogenitet . For eksempel viste en to-trins kemostat med cellegenvinding fra anden til første fase at producere tilfredsstillende resultater . Yderligere forfining til modellering af den voksne humane kolon blev udført af Macfarlane et al. ved hjælp af et tre-trins sammensat kontinuerligt kultursystem. Dette blev mikrobiologisk valideret mod humant kolonmateriale opnået fra pludselige dødsofre ved obduktion. Sådanne modeller er værdifulde til at studere tarmmikrofloraen, da forskellige fysisk-kemiske tilstande kan kontrolleres. Dette har klare økonomiske fordele, men er især relevant for planlægning af menneskelige studier.

forskelle i fækalfloraen afspejles også i varierende laktat -, kort-(SCFA) og forgrenede fedtsyremønstre, som er mellemprodukter og slutprodukter af bakteriel fermentering . Deres produktionshastighed og fermenteringsmønster kan også bestemmes af substrattilgængelighed for tarmbakteriefloraen . Derfor kan ændringer i fækalfloraen fra en ændring i kosten eller antimikrobiel terapi også medføre en ændring i fermenteringsmønstre og organisk syrekoncentration . Mængden af sådanne syrer produceret hos mennesker er vanskelig at bestemme, og der er kun udført et lille antal undersøgelser, der indikerer, at der hos voksne produceres mellem 300 mmol og 1-2 mol syre hver dag. Acetat blev fundet at være den vigtigste SCFA produceret i alle tilfælde, og bevis tyder på, at caecal SCFA-koncentrationer er omtrent det dobbelte af dem i recto-sigmoid-området .

to mælkekomponenter har tidligere vist sig at hæmme gastrointestinale infektioner og / eller stimulere bifidobakterier in vitro. Glycomacropeptid (GMP), et derivat af kurshasein, er blevet grundigt undersøgt in vitro og viste sig at hæmme adhæsionen af bakterier, vira og toksiner til cellemembranen gennem binding til patogenens receptorsteder . Disse in vitro-analyser viste også, at GMP stærkt fremmede væksten af Bifidobacterium breve, B. bifidum, B. infantis og Lactococcus lactis. det har vist sig, at den har en tertiær struktur, der kan sammenlignes med C-type lysosymer, har lignende virkninger . Pihlanto-Lepp LARP et al. tidligere viste det sig, at karrus-la sænkede den metaboliske aktivitet af Escherichia coli JM103 til kun 21% af det normale. Derudover viste testningen af renset komælk, at Kurt-la var en potent vækstpromotor for B. infantis og B. breve.

i denne undersøgelse brugte vi batchkultur og et to-trins sammensat kontinuerligt kultursystem til at teste fermenteringsegenskaber og bakterielle aktiviteter efter tilskud af modermælkserstatning feeds med kurr-la og GMP. Det kontinuerlige kultursystem blev tilpasset fra tretrinsmodellen udviklet af Macfarlane et al. . Dens mindre driftsvolumen og hurtigere omsætningshastigheder forsøgte at tage højde for de fysiske faktorer, der findes hos spædbørn. Vi testede, om tilskud af karrus-la og GMP kan ændre den gastrointestinale flora for at give lignende fordele som dem, der observeres hos ammede spædbørn.

2 Materialer og metoder

2.1 batchkultur

for de anaerobe batchkultursystemer indeholdt det basale dyrkningsmedium (pr.liter): 1 g pepton, 1 g gærekstrakt, 0,05 g NaCl, 0,02 g K2HPO4, 0,02 g KH2PO4, 0,005 g MgSO4·7H2O, 0,005 g CaCl2·6H2O, 1 g NaHCO3, 1 ml mellem 80, 0.0025 g haemin, 5 liter vitamin K1, 0,25 g cysteinhci og 0,25 g galdesalte opløst i 500 ml deioniseret vand, justeret til pH 7,0 og steriliseret ved autoklavering. Alle kemikalier blev opnået fra Sigma (Poole, Dorset, UK), medmindre andet er angivet. Sterilt medium (50 ml) blev anbragt i 100 ml batchdyrkningsflasker indeholdende 0,5 g (1% vægt/v) med en testformel (Arla Foods Ingredients, Viby, Danmark) suppleret med enten Kurt-la (68% vægt/v) eller GMP (80% vægt/v) og opretholdt under en atmosfære af iltfri nitrogengas. Formlerne blev sammenlignet med en standard indeholdende 1% (vægt/vægt) lactose. Den følgende dag blev en frisk fækal prøve opsamlet i en stomacherpose og behandlet straks. Forsøget blev gentaget fem gange ved hjælp af fem forskellige donorer.

batchdyrkningsbeholderne blev inokuleret med 5 ml af en 10% (vægt / v) fækal opslæmning fra raske voksne frivillige tilberedt med anaerob fosfatbufret saltvand (PBS, 0,1 M, pH 7,2), og 1 ml prøver blev udtaget til tider 0 (før prøve blev anbragt i batchkultur), 6 timer og 24 timer og opbevaret ved 4 kg C indtil videre brug. Til optælling af bakterier ved fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) blev 375-triplicater af den opsamlede prøve fjernet og tilsat til et 1,5 ml Eppendorf-rør indeholdende 1125-filtersteriliseret 4% (vægt/v) paraformaldehyd i PBS (pH 7,2) og fikseret i mindst 4 timer ved 4 liter C. Den faste prøve blev derefter centrifugeret i 5 minutter ved 13 000 liter g, og supernatanten blev kasseret. Pelleten blev resuspenderet i 1 ml filtreret PBS (pH 7,4) indeholdende 0,00001% (vægt/v) cetyltrimethylammoniumbromid og overført til et Eppendorf-rør til afstødning (13 000 liter g, 5 min). Efter vask af pelleten en anden gang blev supernatanten fjernet, og pelleten blev grundigt resuspenderet i 150 liter filtreret PBS og 150 liter 96% (v/v) ethanol. Prøven blev blandet godt og opbevaret ved -20 liter C i mindst 1 time før hybridisering med en fluorescerende sonde (som beskrevet nedenfor).

2.2 to-trins kontinuerligt kultursystem

det kontinuerlige kultursystem bestod af to glasbeholdere, V1 og V2, begge med et driftsvolumen på 100 ml. Temperatur (37 liter C) og pH blev automatisk kontrolleret. Kultur pH i fartøjerne var 5.2 i V1, der repræsenterer det lave pH-miljø i den proksimale kolon og 6,5 i V2, hvilket indikerer en mere neutral pH i den distale kolon. Hver fermentor blev magnetisk omrørt, og vækstmediet blev kontinuerligt sparget med iltfrit nitrogen (15 ml min-1) og fodret fra et glasmediumreservoir af en peristaltisk pumpe. V1 leverede sekventielt V2 via et overløb og en række overløb. Overløbet fra V2 blev ført til en affaldsbeholder. Dyrkningsmediet bestod af (A) det ovenfor beskrevne basalmedium med 1% (vægt/v) lactose tilsat (Sigma, Poole, Dorset, UK), (B) human modermælk (leveret af Royal Berkshire Hospital, Reading, UK) med 0,5 g l−1L-cystein-HCl tilsat, (C) testformel med 68% (vægt/v) supplerende Karp-la, 1% (vægt/v) lactose og 0,5 g l−1L-cystein-HCl og (D) testformel med 68% (vægt/v) supplerende Karp−la, 1% (vægt/v) lactose og 0,5 g l-1L-cystein-HCl og (D) testformel med 68% (vægt / v) supplerende (vægt / v) GMP, 1% (vægt / v) lactose og 0,5 g l-1L-cystein-HCL. Alle formler blev opnået fra Arla Foods Ingredients (Viby, Danmark) og præfordøjet under anvendelse af pepsin (575 E pr.g protein) ved pH 2 for 2 timer (37 liter C) efterfulgt af pancreatin (50 E pr. g protein) og 0,5 g l−1 volumen galdesyre ved pH 6,5 for to timer (37 liter C). For at sikre anaerobicitet blev 4 ml l−1 af en 250 mg l−1 stamopløsning af resurin kogt og tilsat til mediet. Medierne blev derefter opvarmet til 80 liter C i 20 minutter, afkølet til stuetemperatur natten over og opvarmet til 80 liter C i yderligere 20 minutter, før de kontinuerligt sparges med O2-fri N2. Systemet blev betjent ved en retentionstid (R) på 12 timer beregnet som reciprok af fortyndingshastigheden. Systemretentionstid udgjorde summen af individuelle R-værdier i hver fermenter. Hver fermenter blev inokuleret med 15 ml af en frisk 10% (vægt/v) fækal opslæmning fra raske spædbarnsdonorer mellem 1 og 6 måneder og fodret modermælk med supplerende formel. Opslæmningen blev fremstillet under anvendelse af anaerobe 0,1 M PBS (pH 7,2). Alle forsøg blev gentaget fem gange ved anvendelse af forskellige donorer med undtagelse af gruppe B (modermælk), hvor eksperimentet blev udført en gang ved anvendelse af fækalt materiale fra en 3 måneder gammel, udelukkende ammet donor. Gruppe C og D indeholdt hver fem forskellige individer. Der blev udtaget prøver efter 1, 3 og 6 måneders alderen for at vurdere eventuelle forskelle i fækal mikroflora og eventuelle ændringer i effektiviteten af kosttilskud, efterhånden som spædbørnene modnede. Fermenteringssystemet fik lov til at ækvilibrere natten over, før mediumpumpen blev startet, og blev kørt i mindst 144 timer for at etablere steady state-forhold. Der blev udtaget 3 ml prøver af det oprindelige inokulum (N) efter ækvilibrering (T0) og ved steady state (TS) og forberedt til analyse af fisk som beskrevet ovenfor.

2.3 bakteriel optælling gennem fisk

Oligonukleotidprober (tabel 1) For Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp./ Enterococcus, Bacteroides spp. , Clostridium histolyticum group og E. coli blev syntetiseret og monomærket i 5 ‘ – enden med Cy3 (eks 552 nm, Em 568 nm) af enten Eurogentec (Abingdon, UK) eller MVG-Biotech (Milton Keynes, UK). Hybridisering blev udført natten over ved 50 C for Bifidobacterium og Clostridium, ved 45 C for Lactobacillus og Bacteroides og ved 37 C for E. coli. Til hybridisering blev 200 liter filtreret buffer (40 mM Tris–HCl pH 7,2, 1,8 M NaCl) indeholdende 20 ml l−1 på 10% (vægt/v) SDS og 64 liter HPLC-vand tilsat til 16 liter faste celler og opvarmet til den passende temperatur. Foropvarmet hybridiseringsopløsning (90 liter) blev tilsat til 10 liter af den relevante sonde (slutkoncentration 50 ng liter−1), og opløsningen blev inkuberet natten over i en hybridiseringsovn. For E. coli-sonden blev der tilsat 264-Purpur hybridiseringsbuffer indeholdende 35% (v/v) formamid til 16-Purpur faste celler. Cellerne blev vasket ved tilsætning af 5 ml vaskebuffer (20 mM Tris–HCl pH 7,2, 0,9 M NaCl) til 5-100 liter hybridiseret prøve, farvet med 20 liter 4’,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, eks 344, Em 450; 500 ng ml−1) og inkuberet i en hybridiseringsovn i 30 minutter. For det samlede antal blev 5-12 liter prøve vakuumfiltreret på et 0,2 liter porestørrelse polycarbonatfilter (Millipore, Vandford, UK) og anbragt på et mikroskopglas. For at undgå fading af proberne blev en dråbe Langsomfade-lys Antifade Kit komponent A (Molecular Probes Europe, Leiden, Holland) tilsat til filteret. Slides blev undersøgt mikroskopisk ved hjælp af en Epi-fluorescens vedhæftet fil (Nikon UK, Kingston upon Thames, UK). UV-lys blev brugt til at tælle DAPI-farvede bakterier, og Cy3-farvede celler blev opregnet ved 550 nm. Femten tilfældige felter med en god fordeling af celler (10-100) blev talt for hver sonde og prøve.

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

2.4 Volatile acid analysis

Undiluted aliquots (1.0 ml) prøve blev dispenseret i 1,5 ml Eppendorf-rør og centrifugeret (13 000 liter g, 5 min) til pelletbakterier og andre faste stoffer. Supernatanten blev derefter filtreret under anvendelse af et 0,2-liters polycarbonatfilter og tilsat til fire dele acetonitril indeholdende 4,3 mmol l−1 2-ethylsmørsyre som den interne standard. Kalibrering blev udført ved anvendelse af standardopløsninger af eddikesyre, propionsyre, i-smørsyre, n-smørsyre, i-valerinsyre, n-valerinsyre, n-capronsyre og dl-mælkesyre i acetonitril. Fedtsyrer blev bestemt ved gas-væskekromatografi på et GC-System i Agilent 6890-serien (Agilent, Valdbronn, Tyskland) udstyret med en Optima ffap-søjle (25 m liter 0,32 mm, Macherey-Nagel, D Lyrren, Tyskland) og en flammeioniseringsdetektor. Bæregashelium blev leveret med en strømningshastighed på 1,8 ml min−1. Injektor, søjle og detektor blev sat til henholdsvis 220 liter C, 140 liter C (Isoterm) og 220 liter C. Efter 5 minutter blev søjletemperaturen øget til 240 liter C ved 20 liter C min−1 trin for at køre i yderligere 15 minutter. Peaks blev integreret ved hjælp af en PC, der kører Atlas Lab-styringsprogrammer (Thermo Lab Systems, Tyskland). Fedtsyrekoncentrationer blev beregnet ved at sammenligne deres spidsarealer med dem i den interne standard og blev udtrykt som millimol pr.liter.

2.5 statistisk analyse

statistisk analyse blev udført ved hjælp af envejs ANOVA (inoculum, versus steady-state, TS) til bestemmelse af signifikans ved P<0.05 medmindre andet er angivet.

3 resultater

3.1 batchkultur

før podning indeholdt prøverne næsten det samme antal Bifidobacterium spp., Bacteroides spp. og Clostridium spp. Lactobacilli var mindre talrige. I kulturer, der indeholder Kurt-la (Fig. 1), samlede antal, bifidobakterier, clostridier, lactobaciller og Bacteroides forblev uændrede. E. coli-tællingerne faldt signifikant (P<0,01) med et tilskud af larrus-la efter 6 timers inkubation, men steg igen til baseline-niveauer (ikke vist).

1

gennemsnitligt bakterietal (log10) i voksne fækale inokulum-og batchkulturer indeholdende basalmedium med 1% (vægt/vægt) lactose) eller 1% (vægt / vægt) testformel. Resultaterne er midler (log10 pr. g vådvægt) Karp S. D. N=fækalt inokulum; 24 timer, lactose=kultur efter 24 timers inkubation indeholdende lactose; 24 timer, a-la/GMP=kultur efter 24 timers inkubation indeholdende Karp-la eller GMP.

1

gennemsnitlige bakterietællinger (log10) i voksne fækale inokulum-og batchkulturer indeholdende basalmedium med 1% (vægt/vægt) lactose) eller 1% (vægt / vægt) testformel. Resultaterne er midler (log10 pr. g vådvægt) Karp S. D. N=fækalt inokulum; 24 timer, lactose=kultur efter 24 timers inkubation indeholdende lactose; 24 timer, a-la/GMP=kultur efter 24 timers inkubation indeholdende Karp-la eller GMP.

kulturer indeholdende GMP (Fig. 1) Generelt opretholdt antal bifidobakterier, Bacteroides, lactobacilli og clostridia. E. coli-tællinger faldt signifikant (P<0,05) efter 6 timers inkubation, men steg igen til basale niveauer (ikke vist).

3.2 to-trins sammensat kontinuerligt kultursystem

i kar, der indeholder det samme standardmedium (basalmedium indeholdende 1% vægt / vægt lactose, Fig. 2), samlede bakterietællinger, bifidobakterier, lactobaciller og clostridier forblev konstante. I modsætning hertil steg Bacteroides signifikant i begge fermenteringsbeholdere efter ligevægt og forblev højere end inokulumniveauer ved steady state i begge kar (P<0,05). Et statistisk signifikant fald (P<0,05) kunne observeres for E. coli i kar 2 (pH 6,5) efter ækvilibrering. Dette blev imidlertid ikke opretholdt, og begge kar havde sammenlignelige E. coli-niveauer ved steady state, som var lavere end inokulumet.

2

gennemsnitligt bakterietal (log10) i fækale inokulum-og kontrolfermenterkar med basalmedium indeholdende 1% (vægt / vægt) lactose eller modermælk (BM). Resultaterne er middel (log10 pr. g vådvægt), S. D. N=fækalt inokulum; V1TS=kar 1 ved steady state (pH 5,2); V2TS=kar 2 ved steady state (pH 6,5).

2

gennemsnitlige bakterietællinger (log10) i fækale inokulum-og kontrolfermenterkar med basalmedium indeholdende 1% (vægt / vægt) lactose eller modermælk (BM). Resultaterne er middel (log10 pr. g vådvægt), S. D. N=fækalt inokulum; V1TS=kar 1 ved steady state (pH 5,2); V2TS=kar 2 ved steady state (pH 6,5).

efter beholderne indeholdende modermælk (Fig. 2) blev overladt til at ækvilibrere i 24 timer, blev der observeret en statistisk signifikant stigning (P<0,05) for lactobaciller i kar 2 (pH 6.5), som blev bevaret, indtil steady state blev nået. Bifidobacterium-tællingerne forblev stabile. I modsætning hertil faldt clostridia (P<0,01) signifikant i begge kar og forsvandt fuldstændigt fra kar 1 (pH 5,2) ved steady state. Lignende fald (P<0,05) blev observeret for E. coli i kar 1 (pH 5,2), men ikke i kar 2 (pH 6,5). Kar, der indeholdt karrus-la og blev podet med fækale prøver fra 1 – og 3 måneder gamle spædbørn, havde stabile totalantal samt niveauer af andre bakterier (ikke vist). Når fermentorerne blev podet med fækale prøver opnået fra 6 måneder gamle spædbørn (Fig. 3) forblev det samlede antal og antallet af lactobaciller uændret. Antallet af Bacteroides, clostridia og E. coli faldt mærkbart efter ækvilibrering, og der blev observeret en statistisk signifikant reduktion (P<0, 05) ved begge pH-niveauer. Fartøjer indeholdende GMP og inokuleret med fækalprøver fra 1 – og 3 måneder gamle spædbørn havde samlede tal, Bacteroides og E. coli, der svingede, men forblev stabile. Som det blev observeret med Kurt-la, viste lactobaciller en svag opadgående tendens sammenlignet med de indledende prøver, men statistisk signifikans blev ikke observeret (ikke vist). Når fermentorerne blev podet med fæces fra 6 måneder gamle spædbørn (Fig. 3), samlede antal, lactobaciller og bifidobakterier forblev uændrede. Bacteroides, clostridium og E. coli-tællinger faldt mærkbart efter ligevægt, og en statistisk signifikant reduktion (P<0,05), svarende til den, der blev set med en formel, der blev suppleret med en kurr-la, blev observeret ved begge pH-niveauer.

3

gennemsnitlige bakterietællinger i inokulum-og fermenteringskar (log10), der indeholder LARP-la eller GMP ved hjælp af fæces fra 6 måneder gamle donorer. Resultaterne er middel (log10 pr. g vådvægt), S. D. N=fækalt inokulum; V1TS=kar 1 ved steady state (pH 5,2); V2TS=kar 2 ved steady state (pH 6,5).

3

gennemsnitlige bakterietællinger i inokulum-og fermenteringskar (log10), der indeholder Purpur-la eller GMP ved hjælp af fæces fra 6 måneder gamle donorer. Resultaterne er middel (log10 pr. g vådvægt) karret S. D. N=fækalt inokulum; V1TS=kar 1 ved steady state (pH 5.2); V2TS=beholder 2 ved steady state (pH 6,5).

3, 3 organiske syrer

samlede mængder organiske syrer varierede signifikant statistisk (P<0, 05) mellem inokulaen og prøvetiderne med gennemsnitlig total syre for inokulaen 4, 28 mmol l−1, 8, 16 mmol l−1 og 15, 64 mmol l−1 sammenlignet med 73, 80 mmol/l−1 (interval 18, 93–160, 49), 39, 29 mmol l−1 (interval 15, 30–100, 28) og 80, 49 mmol l−1 (interval 28, 07–177, 34) for henholdsvis 1 -, 3 – og 6 måneder gamle donorer. Standardfejl var 4.96%, 3.10%, 2.61%, 1.80%, 0.91%, 0.84%, 1.91% og 5.12% for henholdsvis acetat, propionat, i-butyrat, n-butyrat, i-valerat, n-valerat, caproat og lactat. Acetat var den dominerende syre i alle grupper (Fig. 4) efterfulgt af lactat og propionat, i gennemsnit 63%, 21%, 11% af den samlede syre henholdsvis. D (-) – lactat blev overvejende fundet sammenlignet med l (+) – lactat, som kun forekom sporadisk og i minimale mængder. Der blev ikke fundet nogen statistisk signifikante forskelle mellem studiegrupper for isoacider, valerat og caproat, som forekom i spormængder.

4

gennemsnitlige relative mængder (%) syre i fermenteringskar. Diæter: N=inokulum; a-la (Kurt-la)=Kurt-lactalbumin; GMP=glycomacropeptid; BM=modermælk. Donoralder: 1=1 måned; 3=3 måneder; 6=6 måneder efter fødslen.

4

gennemsnitlige relative mængder (%) syre i fermenteringskar. Diæter: N=inokulum; a-la (Kurt-la)=Kurt-lactalbumin; GMP=glycomacropeptid; BM=modermælk. Donoralder: 1=1 måned; 3=3 måneder; 6=6 måneder efter fødslen.

Der var dog en statistisk signifikant forskel (P< 0.05) mellem grupperne for de relative mængder af de vigtigste syrer og n-butyrat. Acetat og lactat forekom generelt i et forhold på 3: 2 med undtagelse af inokulumet hos 6 måneder gamle spædbørn, hvor lactat dominerede (P<0,01). n-Butyratkoncentrationer steg generelt med donoralderen, mens propionat faldt, indtil begge var omtrent ens i koncentration. Små mængder i-butyrat blev også fundet i alle donoraldergrupper såvel som i modermælksgruppen.

4 Diskussion

baseret på tidligere undersøgelser antages det generelt, at ammede spædbørn kan have gavn af mikrobiota, der er numerisk domineret af bifidobakterier og / eller lactobaciller . det blev tidligere fundet, at det var signifikant at stimulere udvalgte rene kulturer af bifidobakterier in vitro. Imidlertid, lignende resultater blev ikke set her i blandet kultur. I indledende batchkulturer inokuleret med voksent fækalt materiale blev der ikke observeret nogen statistisk signifikant effekt på den gavnlige mikroflora. Det samme var tilfældet for begge kosttilskud, når de blev brugt i kontinuerlig kultur podet med fækalt materiale fra spædbørn i forskellige aldersgrupper. På trods af dette var bifidobakterier den dominerende gruppe i både testformlerne og modermælkskontrollen, hvor bifidobakterier også forblev konstante gennem hele eksperimentet. En mere dybtgående virkning blev set for lactobaciller. Brystmælk øgede signifikant lactobaciller. En mindre, men statistisk ubetydelig stigning i antallet af lactobaciller blev vist med GMP i fæces hos 3 måneder gamle spædbørn, en tendens, der fortsatte i forsøg med fækalt materiale hos 6 måneder gamle spædbørn.

begge formeltilskud menes også at have en vis hæmmende virkning på en række patogener. GMP blev tidligere vist at have flere anti-patogene egenskaber i både dens kulhydratkæde indeholdende N-acetylneuraminsyre (sialinsyre) såvel som i dens polypeptiddel . Tilstedeværelsen af sialinsyrer på overfladen af tarmceller er ofte nødvendig for infektion af en række enteriske patogener, og en eksogen kilde til GMP kan hæmme bakteriel vedhæftning, hvilket er afgørende for infektion. Dette er blevet påvist ved at hæmme adhærensen af enteropatogen E. coli til humane tarmcellelinjer. Generelt er koncentrationen af sialinsyreholdige komponenter højere i modermælk end i modermælkserstatninger. En hæmmende virkning af GMP på Bacteroides, clostridia og E. coli, tre potentielt patogene organismer, blev observeret i denne undersøgelse. Mens der i indledende batchkulturer ved anvendelse af voksne fækale materialetællinger generelt blev konserveret, en nedadgående tendens blev set i kontinuerlig kultur. Imidlertid blev en statistisk signifikant reduktion af disse organismer kun påvist i kulturer, der kører fækalt materiale hos 6 måneder gamle spædbørn. Lignende resultater blev observeret i modermælk, hvilket signifikant nedsatte clostridia og E. coli, mens Bacteroides forblev uændrede. I modsætning hertil øgede basalmediet signifikant niveauerne af Bacteroides, hvilket viste, at ændringer i floraens sammensætning ikke var et resultat af udvaskning, men afhang af fermenteringsmediet.

en regulerende komponent af lactosesyntase deler et højt niveau af sekvensidentitet til C-type lysosymerog har en lignende tredimensionel struktur, der antyder, at de kom fra et fælles forfædres gen . Flere undersøgelser er blevet udført for at tyde på, at Kurra-la kan have lignende virkninger på patogener . I modsætning hertil Pelligrini et al. fandt, at proteolytisk fordøjelse af trypsin og pepsin gav tre peptider med bakteriedræbende egenskaber, for det meste aktive mod gramnegative organismer. Bakteriostatiske egenskaber af hydrolyseret Larus-la blev set specifikt for E. coli. I denne undersøgelse blev der observeret en hæmmende virkning af Kurt-la på Bacteroides, clostridia og E. coli. Igen blev en statistisk signifikant reduktion af disse organismer kun påvist i kulturer, der kører fækalt materiale hos 6 måneder gamle spædbørn, et resultat, der kan sammenlignes med det, der blev opnået for modermælkskontrol.

vores undersøgelse bekræftede, at acetat var den vigtigste SCFA hos ammede sammenlignet med flaskefodrede spædbørn sammen med lave koncentrationer af propionat og et næsten totalt fravær af butyrat i de første 117 dage af livet . Lactat og acetat forekom generelt i et forhold på 2:3, hvilket bekræfter den dominerende rolle bifidobakterier i mikrofloraen som beskrevet af Rasic og Kurmann . En høj forekomst af lactat er også typisk for ufuldstændig eller hurtig gæring, der ofte er forbundet med en sur pH, som det ses hos ammede babyer . Dette blev imidlertid ikke bekræftet her, da fækalt inokulum af ammede donorer, der fermenterede modermælk, producerede en syreprofil næsten fuldstændig blottet for lactat. På den anden side frembragte fækale prøver, der fermenterede Kurt-la – og GMP-suppleret formel, en syreprofil, der var karakteristisk for formelfermentering med højere koncentrationer af n-butyrat, som steg med donoralderen . Acetat forblev dog stadig dominerende som set hos udelukkende ammede spædbørn.

i Sammendrag har vi vist de mikrobiologiske virkninger af tilskud af modermælkserstatninger med LARP-la og GMP. Sammenlignet med tidligere in vitro-undersøgelser ved anvendelse af rene kulturer af bifidobakterier blev der ikke observeret en bifidogen virkning af de to kosttilskud ved anvendelse af fækal inokula. Der blev imidlertid observeret en statistisk signifikant reduktion af den potentielt patogene mikroflora, som svarede til den, der blev observeret hos ammede spædbørn. I denne sammenhæng kan det således konkluderes, at tilskud af karrus-la og GMP i kombination med store mængder Acetat har gavnlige virkninger på den humane mikroflora.

anerkendelser

forskerne vil gerne takke Fru Alethea Hill såvel som donorerne og deres forældre for deres støtte, entusiasme og uvurderlig hjælp til undersøgelsen.

Borriello
S. P.

(

1986

)

mikrobiel flora i mave-tarmkanalen

. I:

mikrobiel metabolisme i fordøjelseskanalen

(

Hill
M. J.

, Red.), PP.

2

16

.

CRC Tryk

,

Boca Raton, FL

.

fra Sonnenborn
Stobernack
H.-P.
Proppert
Y.

(

1990

)

udviklingen af anaerob tarmflora hos nyfødte

.

fremskridt. Middelhavs.
108

,

420

424

.

Mitsuoka
T.

(

1995

)

komparativ intestinal mikrobiel økologi og metabolisme hos mennesker og dyr

. I:

Medicinsk og Dental Aspekter af Anaerobes

(

Duerden
B. I.

Wade
W. G.

Fyrfad
J. S.

Eley
A.

Wren
B.

Hudson
M. J

, Eds.), PP.

87

107

.

videnskab anmeldelser

.

H. J. M.
Vildboer-Veloo
A. C. M.

Raangs
G. C.

et al. (

2000

)

analyse af tarmfloraudvikling hos ammede og formelfodrede spædbørn ved hjælp af molekylære identifikations-og detektionsmetoder

.

J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr.
30

,

61

67

.

S.
Bouley
C.

Boutron-Ruault
M.-C.

et al. (

1998

)

funktionel Fødevarevidenskab og gastrointestinal fysiologi og funktion

.

Br. J. Nutr.
80

,

S147

S171

.

H. J. M.
Gibson
G. R.

et al. (

1999

)

sammenligning af brugbare celletællinger og fluorescens in situ hybridisering ved hjælp af specifikke rRNA-baserede prober til kvantificering af humane fækale bakterier

.

FEMS Microbiol. LETT.
183

,

125

129

.

Macfarlane
G. T.

Gibson
G. R.
S.

(

1994

)

kortkædet fedtsyre og laktatproduktion af humane tarmbakterier dyrket i batch og kontinuerlig kultur

. I:

kortkædede fedtsyrer

(

bindemiddel
Cummings
J. H.
Soergel
K. H.

Eds.), PP.

44

60

.

Copenhagen

,

København

.

Allison
McFarlan
C.

Macfarlane
G. T.

(

1989

)

undersøgelser af blandede populationer af humane tarmbakterier dyrket i enkelt-og flertrins kontinuerlige Kultursystemer

.

Appl. Ca. Mikrobiol.
55

,

679

683

.

Marsh
P.

(

1995

)

rollen som kontinuerlig kultur i modellering af den menneskelige mikroflora

.

J. Chem. Højteknologisk. Biotechnol.
64

,

1

9

.

B. G.
I.
I.

(

1981

)

simulering af rotten intestinal økosystem ved hjælp af et to-trins kontinuerligt kultursystem

. J. Gen. Microbiol .

123

,

103

115

.

G. T.
Macfarlane
S.
Gibson
G. R.

(

1998

)

validering af et tretrins sammensat kontinuerligt kultursystem til undersøgelse effekten af retentionstid på økologi og metabolisme af bakterier i den humane kolon

.

mikrob. Ecol.
35

,

180

187

.

C. A.

Parrett
S. E.
B. A.

(

1994

)

fækale kortkædede fedtsyrer hos ammede og formelfodrede babyer

.

Acta Paediatr.
83

,

459

462

.

Cummings
J. H.

(

1983

)

gæring i den menneskelige tyktarm: bevis og konsekvenser for helbredet

.

Lancet
1

,

1206

1208

.

Midtvedt
Carlstedt-Duke
B.
h T.

et al. (

1986

)

indflydelse af peroral antimikrobiel på den biotransformatoriske aktivitet af tarmmikrofloraen hos raske forsøgspersoner

.

Eur. J. Blink. Investere.
16

,

11

17

.

H.

(

1997

)

Biological significance of sialic acid-containing substances in milk and their application

.

Recent Res. Dev. Agric. Biol. Chem.
1

,

193

207

.

Idota
T.

Kawakami
H.

Nakajima
I.

(

1994

)

Growth-promoting effects of N-actelylneuraminic acid containing substances on bifidobacteria

.

Biosci. Biotechnol. Biochem.
58

,

1720

1722

.

Bouhallab
Favrot
Maubois
J. L.

(

1993

)

vækstfremmende aktivitet af tryptisk fordøjelse af caseinomacropeptid til Lactococcus lactis ssp. lactis

.

mælk
73

,

73

77

.

Y.
Lui
J. N.

D.
D.
D.

>

(

2001

)

mutant af Lac-lactalbumin, der virker som lysosym

.

proteiner Struct. Funktion. Genet.
42

,

17

22

.

Marnila
P.

Hubert
L.

Rokka
T.

Korhonen
H. J. T.

(

1999

)

virkningen af larr-lactalbumin og larr-lactalbuminhydrosylater på den metaboliske aktivitet af Escherichia coli jm103

.

J. Appl. Mikrobiol.
87

,

540

545

.

Talbott
D.

(

1991

)

respons af Bifidobacterium arter til vækstfremmere i human-og komælk

.

Pediatr. Res.
29

,

208

213

.

Franks
H. J. M.

Raangs
G. C.

et al. (

1998

)

variationer af bakteriepopulationer i humant afføring målt ved fluorescerende in situ-hybridisering med gruppespecifikke 16S rRNA-målrettede oligonukleotidprober

.

Appl. Ca. Mikrobiol.
64

,

3336

3345

.

div>
rouvet
Guggenheim
B.

(

1994

)

in ved hjælp af denne metode er det vigtigt, at du er sikker på, at du er i stand til at finde ud af, hvad der er bedst. Oral Mikrobiol . Immunol.
9

,

193

201

.

A. E.
Adlerberth
I.

(

2000

)

amning intestinal mikroflora af spædbarnet-konsekvenser for beskyttelse mod infektionssygdomme

. I:

kort-og langtidsvirkninger af amning på børns sundhed

(

B.

et al. , EDS.). forlag

,

København

.

Pelligrini
A.

U.
N.
P.
von Fellenberg
R.

(

1999

)

isolering og identifikation af tre bakteriedræbende domæner i encefalopati alfa-lactalbuminmolekylet

.

Biochim. Biofys. Acta
1426

,

439

448

.

U.

Ormission
A.
Tamm
A.

(

1993

)

fækale kortkædede fedtsyrer hos ammede og flaskefodrede spædbørn

.

Acta Paediatr.
82

,

536

538

.

Yerry
Miller
T. L.

Y.
bank
S.

(

1998

)

ændringer i produktionen af ethanol, syrer og H2 fra glukose ved fækalfloraen hos det 16 – til 158 dage gamle ammede spædbarn

.

J. Nutr.
128

,

85

90

.

Rasic
J. L.
Kurmann
J. A.

(

1983

)

bifidobakterier og deres rolle

.

Birkhauser Verlag

,

Basel

.

Tianan
J.

Savaiano
D. A.

(

1997

)

redigering af kolonfermentering ved bifidobakterier og pH in vitro

.

Dig. Ti. Sci.
42

,

2370

2377

.

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.