Použití dávkové kultury a dvoustupňové kontinuální kultura systém pro studium vlivu doplňkové α-laktalbumin a glycomacropeptide na smíšené populace, lidské střevní bakterie

Abstrakt

Některé mléčné faktory mohou podporovat růst hostitele-přátelský gastrointestinální mikroflóry. To může vysvětlit, proč kojené děti mají méně střevních infekcí než jejich protějšky krmené vzorcem. V této studii byl zkoumán účinek doplnění vzorce dvěma takovými faktory. Kojenecké fekální vzorky byly použity kvasit vzorce doplněny glycomacropeptide a α-laktalbumin ve dvou-fázi složené kontinuální kultury modelu. Bakteriologie byla stanovena fluorescenční hybridizací in situ. Cévy, které obsahovaly mateřské mléko, stejně jako α-laktalbumin a glykomakropeptid, měly stabilní počet bifidobakterií, zatímco laktobacily se významně zvýšily pouze v cévách s mateřským mlékem. Bacteroides, clostridia a Escherichia coli se ve všech bězích významně snížily. Acetát byl hlavní kyselinou nalezenou spolu s vysokým množstvím propionátu a laktátu. Doplnění kojenecké výživy vhodnými mléčnými bílkovinami může být užitečné při simulaci příznivých bakteriologických účinků mateřského mléka.

1 Úvod

lidské tlusté střevo je komplexní ekosystém, který obsahuje širokou škálu bakterií. Předpokládá se, že je přítomno nejméně 400 různých bakteriálních druhů, přičemž na g stolice se nachází až 1012 bakterií . Mikroflóra se získává při narození, přičemž sterilní novorozenec se během procesu porodu kolonizuje různými bakteriemi . Během prvních dnů života převažují nutričně nenáročné prokaryoty, jako jsou enterobakterie, stafylokoky a streptokoky (včetně enterokoků). Během prvního týdne života se vytvoří rody, jako jsou bifidobakterie a Bacteroidy . To je si myslel, že kojené děti mají střevní flóru, která je početně převládají bifidobakterie, zatímco ti, kteří jsou na sunaru mají složitější mikroflóry, které jsou podobné v složení těch dospělých . Bifidobakterie mohou mít silné antimikrobiální účinky proti různým střevním patogenům, jako jsou určité Enterobacteriaceae a Clostridium spp. Jako taková je převaha bifidobakterií považována za jeden ukazatel zlepšeného zdraví střev . Pozorování na normální střevní mikroflóry byly do značné míry odvozené z kvantitativní deska kultury a fenotypová charakterizace, které mají omezení, pokud jde o účinnost rekuperace a provozovatel subjektivity .

Navíc, jako proximální tlustého střeva je fyzicky nepřístupné pro běžné účely, většina mikrobiální studie fermentace byly prováděny s fekální bakterie v jedné dávce kultury nebo jednostupňový chemostats . Dávková kultura umožňuje stanovení fermentovatelnosti různých substrátů během krátkých období (24 h). Nicméně, existují významné rozdíly v dostupnosti substrátu a podmínkách prostředí mezi proximální a distální tlustého střeva, které nemohou být simulovány v jedné nádobě systému .

naproti tomu systémy in vitro používající více fermentačních nádob uspořádaných do série mají výhody tím, že jsou schopny modelovat složitější podmínky prostředí a zároveň umožňují prostorovou a časovou heterogenitu . Bylo například prokázáno, že dvoustupňový chemostatik s recyklací buněk od druhého do prvního stupně vede k uspokojivým výsledkům . Další zdokonalení pro modelování dospělého lidského tlustého střeva provedli Macfarlane et al. použití třístupňového sloučeninového kontinuálního kultivačního systému. To bylo mikrobiologicky ověřeno proti lidskému materiálu tlustého střeva získanému od obětí náhlé smrti při pitvě. Takové modely jsou cenné pro studium střevní mikroflóry, protože lze ovládat různé fyzikálně-chemické podmínky. To má jasné ekonomické výhody, ale je zvláště důležité pro plánování lidských studií.

rozdíly ve fekální flóře se také odrážejí v různých vzorcích mastných kyselin laktátu, krátkého (SCFA) a rozvětveného řetězce, které jsou meziprodukty a konečnými produkty bakteriální fermentace . Jejich rychlost produkce a fermentační vzorec mohou být také určeny dostupností substrátu pro střevní bakteriální flóru . Proto mohou změny ve fekální flóře způsobené změnou stravy nebo antimikrobiální terapií také způsobit změnu ve vzorcích fermentace a koncentraci organických kyselin . Množství těchto kyselin produkovaných v lidských subjektů je obtížné určit, a jen malý počet byly provedeny studie, které naznačují, že u dospělých, mezi 300 mmol a 1-2 mol kyseliny jsou vyráběny každý den. Acetátem bylo zjištěno, že hlavní SCFA vyrábí ve všech případech, a důkazy naznačují, že slepých střev SCFA koncentrace jsou přibližně dvojnásobné v recto-sigmoid oblasti .

dvě složky mléka již dříve prokázaly inhibici gastrointestinálních infekcí a / nebo stimulaci bifidobakterií in vitro. Glycomacropeptide (GMP), derivát κ-kasein, byl intenzivně studován in vitro a bylo prokázáno, že inhibují adhezi bakterie, viry a toxiny na buněčné membráně prostřednictvím vazby na receptory patogenu . Tyto testy in vitro také ukázaly, že GMP silně podporoval růst Bifidobacterium breve, B. bifidum, B. infantis a Lactococcus lactis. ukázalo se, že α-laktalbumin (α-la), který má terciární strukturu srovnatelnou s lysozymy typu c, má podobné účinky . Pihlanto-Leppälä et al. dříve se ukázalo, že α-la snížila metabolickou aktivitu Escherichia coli JM103 na pouhých 21% normálu. Kromě toho testování vyčištěného kravského mléka ukázalo, že α-la byl silným růstovým promotorem pro B. infantis a B. breve.

V této studii jsme použili dávku kultury a dvoustupňový sloučenina, kontinuální kultura systém k testování fermentace vlastnosti a bakteriální činností po doplnění kojenecké výživy kanály s α-la a GMP. Systém kontinuální kultury byl upraven z třístupňového modelu vyvinutého Macfarlane et al. . Jeho menší provozní objem a rychlejší míra obratu se pokusily zohlednit fyzikální faktory nalezené u lidských kojenců. Testovali jsme, zda suplementace α-la a GMP může změnit gastrointestinální flóru, aby poskytla podobné výhody jako u kojených dětí.

2 Materiály a metody

2.1 Dávku kultury

Pro anaerobní dávku kultury systémů, bazální kultivační médium obsahovalo (na litr): 1 g peptonu, 1 g kvasničného extraktu, 0,05 g NaCl, 0,02 g K2HPO4, 0.02 g KH2PO4, 0,005 g MgSO4·7H2O, 0,005 g CaCl2·6H2O, 1 g NaHCO3 1 ml Tween 80, 0.0025 g heminu, 5 µl vitaminu K1, 0,25 g cysteinu HCl a 0,25 g žlučových solí rozpuštěných v 500 ml deionizované vody, upravených na pH 7,0 a sterilizovaných autoklávováním. Všechny chemikálie byly získány od společnosti Sigma (Poole, Dorset, UK), pokud není uvedeno jinak. Sterilní médium (50 ml) byl umístěn do 100-ml dávce kultury lahve s obsahem 0,5 g (1% w/v) testovací vzorec (Arla Foods Ingredience, Viby, Dánsko), doplněné buď α-la (68% w/v) nebo GMP (80% w/v) a udržuje v atmosféře bez kyslíku-dusíku. Vzorce byly porovnány se standardem obsahujícím 1% (hmotnostních) laktózy. Následující den byl odebrán čerstvý vzorek stolice v sáčku stomacher a okamžitě zpracován. Experiment byl opakován pětkrát za použití pěti různých dárců.

dávkový kultivační nádoby byly naočkovány s 5 ml 10% (w/v) fekální suspenze od zdravých dospělých dobrovolníků připravených s anaerobní fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS, 0,1 M, pH 7,2) a 1 ml vzorky byly odebrány v časech 0 (před umístěním vzorku v dávce kultury), 6 h a 24 h, a skladuje se při 4°C až do dalšího použití. Pro počítání bakterií pomocí fluorescenční hybridizace in situ (FISH), 375-µl kopie z odebraného vzorku byl odebrán a přidán do 1,5 ml mikrozkumavky obsahující 1125 µl filtr-sterilované 4% (w/v) paraformaldehydem v PBS (pH 7,2) a pevné po dobu nejméně 4 hodin při teplotě 4°C. pevný vzorek byl poté odstředěny po dobu 5 min při 13 000×g a supernatant zlikvidovat. Pelety byly resuspendovány v 1 ml filtrovaného PBS (pH 7.4) obsahující 0.00001% (w/v) cetyl trimethyl ammonium bromid a převedeny do mikrozkumavky pro repelleting (13 000×g, 5 min). Po umytí pelety podruhé, supernatant byl odstraněn a peleta důkladně resuspendovány v 150 µl filtrovaného PBS a 150 µl 96% (v/v) ethanolu. Vzorek byl dobře promíchán a uchováván při -20°C po dobu nejméně 1 hodiny před hybridizací fluorescenční sondou (jak je popsáno níže).

2.2 dvoustupňový kontinuální kultivační systém

kontinuální kultivační systém sestával ze dvou skleněných nádob, V1 a V2, obě s provozním objemem 100 ml. Teplota (37°C) a pH byly automaticky řízeny. Kultivační pH v nádobách bylo 5.2 ve V1, představující prostředí s nízkým pH proximálního tlustého střeva a 6,5 V V2, což svědčí o neutrálnějším pH v distálním tlustém střevě. Každý fermentor byl magneticky míchán a růstové médium kontinuálně jiskřilo dusíkem bez kyslíku (15 ml min-1)a přiváděno ze zásobníku skleněného média peristaltickou pumpou (Watson-Marlow, Falmouth, UK) do V1. V1 postupně dodáván V2 přes přetečení a řadu jezů. Přetečení z V2 bylo vedeno do kontejneru na odpad. Kultivační médium se skládala z (A) bazální médium je popsáno výše s 1% (w/v) laktózy přidáno (Sigma, Poole, Dorset, UK), (B) mateřského mléka (za předpokladu, Royal Berkshire Hospital, Reading, velká BRITÁNIE) s 0,5 g l−1 l-cystein-HCl, přidáno, (C) testovací vzorec s 68% (w/v) doplňkové α-la, 1% (w/v) laktózy a 0,5 g l−1 l-cystein-HCl, a (D) test formule s 68% (w/v) GMP, 1% (w/v) laktózy a 0,5 g l−1 l-cystein-HCl. Všechny vzorce byly získány od Arla Foods Ingredients (Viby, Dánsko) a predigested pomocí pepsinu (575 U / g proteinu) na pH 2 pro 2 h (37°C), následuje pankreatin (50 U / g proteinu) a 0,5 g l−1 objem žlučových kyselin při pH 6,5 na dva h (37°C). K zajištění anaerobicity, 4 ml l−1 z 250 mg l−1 zásobního roztoku resazurin bylo vařené a přidány do média. V médiích se pak zahřívá na 80°C po dobu 20 min, ochladí na teplotu místnosti přes noc a zahřeje na 80°C za 20 min předtím, než je neustále sparged s O2-N2 zdarma. Systém byl provozován v retenční době (R) 12 h, vypočtené jako reciproční rychlost ředění. Retenční čas systému představoval součet jednotlivých hodnot R v každém fermentoru. Každý fermentor byl naočkován 15 ml čerstvé 10% (w/v) fekální kaše od zdravých dárců kojenců ve věku od 1 do 6 měsíců a krmil mateřské mléko doplňkovým přípravkem. Suspenze byla připravena za použití anaerobních 0,1 M PBS (pH 7,2). Všechny experimenty byly opakovány pětkrát pomocí různých dárců, s výjimkou skupiny B (mateřského mléka), kde byl experiment prováděn jednou s použitím fekálií 3-měsíce-starý, výlučně kojené dárce. Skupiny C A D obsahovaly pět různých jedinců. Vzorky byly odebírány po 1, 3 a 6 měsíců věku s cílem posoudit případné rozdíly v fekální mikroflóry a žádné změny v účinnosti doplňků jako děti vyzrálé. Fermentační systém byl povolen k uvedení do rovnováhy přes noc před střední čerpadla byla zahájena, a byl provozován po dobu nejméně 144 h k vytvoření ustáleného stavu. 3-ml vzorky původního inokula (N) po rovnováze (T0) a za ustálených podmínek (TS) byly odebrány a připraveny pro analýzu ryb, jak je popsáno výše.

2.3 výčet bakterií pomocí FISH

oligonukleotidových sond (Tabulka 1) pro Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp./ Enterococcus, Bacteroides spp. , Clostridium histolyticum group A E. coli byly shrnuty a monolabelled na 5′ konci s Cy3 (Ex 552 nm, Em 568 nm) buď Eurogentec (Abingdon, UK), nebo MWG-Biotech (Milton Keynes, UK). Hybridizace byla provedena přes noc při 50°C pro Bifidobacterium a Clostridium, při 45°C pro Lactobacillus a Bacteroides a při teplotě 37°C pro E. coli. Pro hybridizaci, 200 µl filtrované pufru (40 mM Tris–HCl, pH 7.2, 1,8 M NaCl) obsahující 20 ml l−1, 10% (w/v) SDS a 64 µl HPLC vody bylo přidáno 16 µl fixní buňky a zahřeje na příslušnou teplotu. Předehřáté hybridizační roztok (90 µl) bylo přidáno 10 µl příslušné sondy (konečná koncentrace 50 ng µl−1) a roztoku inkubovat přes noc v hybridizační peci. U sondy E.coli bylo k 16 µl fixovaných buněk přidáno 264 µl hybridizačního pufru obsahujícího 35% (obj.) formamidu. Buňky byly promyty přidáním 5 ml promývacího pufru (20 mM Tris–HCl, pH 7.2, 0,9 M NaCl) 5-100 µl hybridní vzorku, barevné s 20 µl 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Ex 344, Em 450; 500 ng ml−1) a inkubovány v hybridizační peci po dobu 30 min. Pro celkový počet bylo 5-12 µl vzorku vakuově filtrováno na polykarbonátový filtr velikosti pórů 0,2 µm (Millipore, Watford, UK) a umístěno na sklíčko mikroskopu. Aby se zabránilo vyblednutí sond, byla do filtru přidána jedna kapka SlowFade-Light Antifade Kit component a (Molecular Probes Europe, Leiden, Nizozemsko). Snímky byly zkoumány mikroskopicky pomocí EPI-fluorescenční přílohy (Nikon UK, Kingston upon Thames, UK). UV světlo bylo použito k počítání bakterií obarvených DAPI a buňky obarvené Cy3 byly vyčísleny při 550 nm. Pro každou sondu a vzorek bylo započítáno patnáct náhodných polí s dobrou distribucí buněk (10-100).

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

1

Genetic probes and sequences used for predominant groups of intestinal bacteria

Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′
Organism Probe Sequence
Bifidobacterium Bif 164 5′-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3′
Lactobacillus Lac 158 5′-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CA-3′
E. coli Ec 1531 5′-CAC CGT AGT GCC TCG TCA TCA-3′
Clostridium His 150 5′-AAA GGA AGA TTA ATA CCG CAT AA-3′
Bacteroides Bac 303 5′-TTT CCY TCT AAT TAT GGC GTA TT-3′

2.4 Volatile acid analysis

Undiluted aliquots (1.0 ml) vzorku bylo dávkováno do 1,5 ml Eppendorf zkumavek a odstředěno (13 000×g, 5 min) na bakterie pelety a jiné pevné látky. Supernatant byl poté filtrován pomocí 0,2 µm polykarbonátového filtru a přidán ke čtyřem dílům acetonitrilu obsahujícím 4,3 mmol l-1 kyseliny 2-ethylmáselné jako vnitřní standard. Kalibrace byla provedena za použití standardních roztoků kyseliny octové, kyseliny propionové, kyseliny i-máselné, kyseliny n-máselné, kyseliny i-valerové, kyseliny n-valerové, kyseliny n-kapronové a kyseliny DL-mléčné v acetonitrilu. Mastné kyseliny byly stanoveny pomocí plynové chromatografie na Agilent 6890 Series GC system (Agilent, Waldbronn, Německo) vybavené Optima FFAP sloupec (25 m×0,32 mm, Macherey-Nagel, Düren, Německo) a plameno-ionizační detektor. Nosný plyn helium byl dodáván při průtoku 1,8 ml min-1. Vstřikovač, kolona a detektor byly nastaveny na 220°C, 140°C (izotermické)a 220°C. Po 5 minutách byla teplota kolony zvýšena na 240°C při krocích po 20°C min−1, aby se běželo dalších 15 minut. Peaks byly integrovány pomocí PC s řídícím softwarem Atlas Lab (Thermo Lab Systems, Mainz, Německo). Mastné kyseliny koncentrace byly vypočteny porovnáním jejich plochy píků s těmi, vnitřního standardu a byly vyjádřeny jako milimolů na litr.

2.5 Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí one-way ANOVA (inokula, versus ustáleném stavu, TS) pro určení významnosti na P<0.05, není-li uvedeno jinak.

3 výsledky

3.1 dávková kultura

před inokulací obsahovaly vzorky téměř identické počty Bifidobacterium spp., Bacteroides spp., a Clostridium spp. Laktobacily byly méně početné. V kulturách obsahujících α-la (obr. 1), celkový počet, bifidobakterie, klostridie, laktobacily a Bacteroidy zůstaly nezměněny. E. coli se počítá významně snížila (P<0.01) s α-la doplnění po 6 h inkubace, ale opět zvýšila na základní úrovni (není zobrazeno).

1

bakteriální počítá (log10) u dospělých fekální inokula a dávkových kulturách obsahující bazální médium s 1% (w/v) laktózy) nebo 1% (w/w) testovací vzorec. Výsledky jsou prostředky (log10 na g mokré hmotnosti)±Sdn=inokulum stolice; 24 h, laktóza=kultura po 24 hodinách inkubace obsahující laktózu; 24 h, a-la / GMP=kultura po 24 hodinách inkubace obsahující α-la nebo GMP.

1

bakteriální počítá (log10) u dospělých fekální inokula a dávkových kulturách obsahující bazální médium s 1% (w/v) laktózy) nebo 1% (w/w) testovací vzorec. Výsledky jsou prostředky (log10 na g mokré hmotnosti)±Sdn=inokulum stolice; 24 h, laktóza=kultura po 24 hodinách inkubace obsahující laktózu; 24 h, a-la / GMP=kultura po 24 hodinách inkubace obsahující α-la nebo GMP.

kultury obsahující GMP (obr. 1) obecně udržované počty bifidobakterií, Bacteroidů, laktobacilů a klostridií. E. coli se počítá významně snížila (P<0.05) po 6 hodinách inkubace, ale, znovu, zvýšil na bazální úrovni (není zobrazeno).

3.2 dvoustupňový systém kontinuální kultivace sloučenin

v nádobách obsahujících stejné standardní médium (bazální médium obsahující 1% hmotnostních laktózy, obr. 2), celkový počet bakterií, bifidobakterie, laktobacily a klostridie zůstaly konstantní. Naproti tomu Bacteroidy významně vzrostly v obou fermentačních nádobách po rovnováze a zůstaly vyšší než hladiny inokula v ustáleném stavu v obou cévách (P<0.05). Statisticky významný pokles (p<0,05) byl pozorován u E. coli v cévě 2 (pH 6,5) po rovnováze. To však nebylo zachováno a obě cévy měly srovnatelné hladiny E. coli v ustáleném stavu, které byly nižší než inokulum.

2

Střední počty bakterií (log10) ve stolici inokula a kontrolních fermentorových cév s bazálním médiem obsahujícím 1% (hmotnostních) laktózy nebo mateřského mléka (BM). Výsledky jsou prostředky (log10 na g hmotnosti za mokra)±Sdn=inokulum stolice; V1TS=nádoba 1 v ustáleném stavu (pH 5.2); V2TS=nádoba 2 v ustáleném stavu (pH 6.5).

2

bakteriální počítá (log10) v trusu inokula a kontrolu fermenter plavidel s bazální médium obsahující 1% (w/v) laktózy nebo mateřského mléka (BM). Výsledky jsou prostředky (log10 na g hmotnosti za mokra)±Sdn=inokulum stolice; V1TS=nádoba 1 v ustáleném stavu (pH 5.2); V2TS=nádoba 2 v ustáleném stavu (pH 6.5).

po cévách obsahujících mateřské mléko (obr. 2) byly ponechány do rovnováhy po dobu 24 hodin, bylo pozorováno statisticky významné zvýšení (P<0,05) u laktobacilů v cévě 2 (pH 6.5), která byla zachována až do dosažení ustáleného stavu. Počty bifidobakterií zůstaly stabilní. Naproti tomu klostridie významně poklesla (p<0, 01) v obou cévách a zcela vymizela z cévy 1 (pH 5, 2) v ustáleném stavu. Podobné snižuje (P<0.05) byly pozorovány pro E. coli v nádobě 1 (pH 5.2), ale ne v lodi 2 (pH 6,5). Cévy obsahující α-la a naočkované fekálními vzorky získanými od 1 – a 3měsíčních kojenců měly stabilní celkový počet i hladiny jiných bakterií(nejsou zobrazeny). Když byly fermentory naočkovány fekálními vzorky získanými od 6měsíčních kojenců (obr. 3), celkový počet a počet laktobacilů zůstaly nezměněny. Bacteroides, clostridia a E. coli se počítá znatelně po ustavení rovnováhy a statisticky významné snížení (P<0.05) byl pozorován v obou hodnotách pH. Cévy obsahující GMP a naočkované vzorky stolice od 1 – a 3měsíční děti měly celkový počet, Bacteroides a E. coli, které kolísaly, ale zůstaly stabilní. Stejně jako u α-la, laktobacily vykázaly mírný vzestupný trend ve srovnání s původní vzorky, ale statistická významnost nebyla pozorována (není zobrazeno). Když byly fermentory naočkovány stolicí od 6měsíčních kojenců (obr. 3), celkový počet, laktobacily a bifidobakterie zůstaly nezměněny. Bacteroides, clostridium a escherichia coli se počítá znatelně po rovnováze a statisticky významné snížení (P<0.05), podobný jako s α-la-doplnit vzorec, byl pozorován v obou hodnotách pH.

3

bakteriální počítá v inokula a fermenter plavidel (log10) obsahující α-la nebo GMP pomocí stolici 6-měsíc-staré dárců. Výsledky jsou prostředky (log10 na g hmotnosti za mokra)±Sdn=inokulum stolice; V1TS=nádoba 1 v ustáleném stavu (pH 5.2); V2TS=nádoba 2 v ustáleném stavu (pH 6.5).

3

bakteriální počítá v inokula a fermenter plavidel (log10) obsahující α-la nebo GMP pomocí stolici 6-měsíc-staré dárců. Výsledky jsou prostředky (log10 na g hmotnosti za mokra)±Sdn=inokulum stolice; V1TS=nádoba 1 v ustáleném stavu (pH 5.2); V2TS=nádoba 2 v ustáleném stavu (pH 6,5).

3.3 Organické kyseliny

Celkové množství organických kyselin statisticky významně lišily (P<0.05) mezi inokula a vzorek times s tím celkem acid pro inokula, že 4.28 mmol l−1, 8.16 mmol l−1 a 15.64 mmol l−1 ve srovnání s 73.80 mmol/l−1 (rozsah 18.93–160.49), 39.29 mmol l−1 (rozmezí 15.30–100.28) a 80.49 mmol l−1 (rozsah 28.07–177.34) pro 1-, 3 – a 6-měsíc-staré dárci, resp. Standardní chyby byly 4.96%, 3.10%, 2.61%, 1.80%, 0.91%, 0.84%, 1.91% a 5.12% pro acetát, propionát, i-butyrát, n-butyrát, i-valerát, n-valerát, kaproát a laktát. Acetát byl převládající kyselinou ve všech skupinách (obr. 4) následuje laktát a propionát, v průměru 63%, 21%, 11% celkové kyseliny. d (-) – laktát byl převážně nalezen ve srovnání s l (+) – laktátem, který se vyskytoval pouze sporadicky a v minimálních množstvích. Nebyly zjištěny žádné statisticky významné rozdíly mezi studovanými skupinami pro izokyseliny, valerát a kaproát, které se vyskytly ve stopových množstvích.

4

Střední relativní množství ( % ) kyseliny ve fermentorových nádobách. Diety: N=inokulum; a-la (α-la)=α-laktalbumin; GMP=glykomakropeptid; BM=mateřské mléko. Věk dárce: 1=1 měsíc; 3=3 měsíce; 6=6 měsíců po narození.

4

Střední relativní množství ( % ) kyseliny ve fermentorových nádobách. Diety: N=inokulum; a-la (α-la)=α-laktalbumin; GMP=glykomakropeptid; BM=mateřské mléko. Věk dárce: 1=1 měsíc; 3=3 měsíce; 6=6 měsíců po narození.

byl však statisticky významný rozdíl (P< 0.05) mezi skupinami pro relativní množství hlavních kyselin a n-butyrátu. Acetát a laktát se obecně vyskytují v poměru 3:2 s výjimkou inokula 6-měsíc-staré děti, kde laktátu převažovaly (P<0.01). koncentrace n-butyrátu se obecně zvyšovaly s věkem dárce, zatímco propionát klesal, dokud nebyly obě koncentrace přibližně stejné. Malá množství i-butyrátu byla také nalezena ve všech věkových skupinách dárců i ve skupině mateřského mléka.

4 Diskuse

na Základě předchozí studie, to je obecně věřil, že kojené děti mohou mít prospěch z mikroflóry, které jsou početně převládají bifidobakterie a/nebo laktobacilů . bylo dříve zjištěno, že α-La a GMP významně stimulují vybrané čisté kultury bifidobakterií in vitro. Podobné výsledky zde však nebyly pozorovány ve smíšené kultuře. V přípravných dávkových kulturách inokulovaných dospělým fekálním materiálem nebyl pozorován žádný statisticky významný účinek na prospěšnou mikroflóru. Totéž platilo pro oba doplňky, pokud byly použity v kontinuální kultuře Inokulované fekálním materiálem od kojenců různých věkových skupin. Navzdory tomu byly bifidobakterie dominantní skupinou jak v testovacích vzorcích, tak v kontrole mateřského mléka, kde bifidobakterie také zůstaly během experimentu konstantní. Výraznější účinek byl pozorován u laktobacilů. Mateřské mléko výrazně zvýšilo laktobacily. Menší, ale statisticky nevýznamný růst laktobacilů počítá bylo prokázáno, že GMP ve stolici 3-měsíc-staré děti, což je trend, který pokračoval v experimentech s použitím fekálií 6-měsíc-staré děti.

oba vzorce doplňky jsou také myšlenka mít nějaký inhibiční účinek na různé patogeny. GMP bylo dříve prokázáno, že mají několik anti-patogenní atributy v obou jeho sacharidového řetězce obsahující N-acetylneuraminic kyseliny (kyseliny sialové), stejně jako v jeho polypeptid část . Přítomnost kyseliny sialové kyseliny na povrch střevní buňky je často nutné pro infekci různými střevními patogeny a exogenní zdroj GMP může inhibovat bakteriální adheze, která je nezbytná pro infekci. To bylo prokázáno Kawakami inhibicí adherence enteropatogenní E. coli k lidským střevním buněčným liniím. Obecně je koncentrace složek obsahujících kyselinu sialovou vyšší v lidském mléce než v kojenecké výživě. Inhibiční účinek GMP na Bacteroides, klostridia A E. coli, tři potenciálně patogenní organismy, byl pozorován v této studii. Zatímco v předběžných dávkových kulturách s použitím dospělého fekálního materiálu byly obecně zachovány počty, v kontinuální kultuře byl pozorován klesající trend. Statisticky významné snížení těchto organismů však bylo zjištěno pouze v kulturách s fekálním materiálem 6měsíčních dětí. Podobné výsledky byly pozorovány u mateřského mléka, které významně snížilo klostridii A E. coli, zatímco Bacteroidy zůstaly nezměněny. V kontrastu, bazální médium významně zvýšené hladiny Bacteroides ukazuje, že změny ve složení flóry nebyly výsledkem wash-out ale závisí na fermentační médium.

α-La, regulační složkou laktózy syntázy, akcie vysokou úroveň identitu sekvence na c-lysozymů typu a má podobné trojrozměrné struktury, což naznačuje, že pochází ze společných předků, gen . Bylo provedeno několik studií, které naznačují, že α-la může mít podobné účinky na patogeny . Naproti tomu Pelligrini et al. bylo zjištěno, že proteolytické trávení trypsinem a pepsinem přineslo tři peptidy s baktericidními vlastnostmi, většinou aktivní proti gramnegativním organismům. Bakteriostatické vlastnosti hydrolyzovaného α-la byly pozorovány specificky pro E. coli. V této studii byl pozorován inhibiční účinek α-la na Bacteroidy, klostridie a E. coli. Statisticky významné snížení těchto organismů bylo opět zjištěno pouze v kulturách s fekálním materiálem 6měsíčních kojenců, což je výsledek srovnatelný s výsledkem získaným u kontrol mateřského mléka.

Naše studie potvrdila, že acetát byl hlavní SCFA v breast-fed ve srovnání s láhev-krmil děti spolu s nízké koncentrace propionátu a téměř naprostá absence butyrát v prvním 117 dnů života . Laktát a acetát se obecně vyskytovaly v poměru 2: 3, což potvrzuje převládající úlohu bifidobakterií v mikroflóře, jak je popsáno Rasicem a Kurmannem . Vysoký výskyt laktátu je také typický pro neúplnou nebo rychlou fermentaci běžně spojenou s kyselým pH, jak je vidět u kojených dětí . To se však zde nepotvrdilo, protože fekální inokulum kojených dárců fermentujících mateřské mléko vytvořilo kyselý profil téměř úplně bez laktátu. Na druhou stranu, fekální vzorky kvasí α-la – a GMP-doplněn vzorec vyrábí kyselina profil charakteristický vzorec kvašení s vyšší koncentrací n-butyrát, který se zvyšuje s dárcem věku . Acetát však stále převládal, jak je patrné u výhradně kojených dětí.

V souhrnu jsme prokázali mikrobiologické účinky suplementace kojenecké výživy α-la a GMP. Ve srovnání s předchozími in vitro studiemi používajícími čisté kultury bifidobakterií nebyl bifidogenní účinek obou doplňků pozorován při použití fekálního inokula. Bylo však pozorováno statisticky významné snížení potenciálně patogenní mikroflóry, které bylo podobné snížení pozorovanému u kojených dětí. V této souvislosti lze tedy dojít k závěru, že suplementace α-la a GMP v kombinaci s vysokým množstvím acetátu má příznivé účinky na lidskou mikroflóru.

Děkujeme

vědci chtěli poděkovat Paní Alethea Hill, stejně jako dárci a jejich rodičům za jejich podporu, nadšení a neocenitelnou pomoc pro studium.

Borriello
S. P.

(

1986

)

Mikrobiální flóry gastrointestinálního traktu

. V:

mikrobiální metabolismus v zažívacím traktu

(

Hill
M. J.

, ed.), pp.

2

16

.

CRC Press

,

Boca Raton, FL

.

y.

(

1990

)

vývoj anaerobní střevní mikroflóry u novorozenců

.

pokračování. Med.
108

,

420

424

.

(

1995

)

srovnávací intestinální mikrobiální ekologie a metabolismus u lidí a zvířat

. V:

Lékařské a Zubní Aspekty Anaerobní bakterie

(

Duerden
B. I.

Wade
W. G.

Pec
J. S.

Eley
A.

Wren
B.

Hudson
M. J

, Eds.), pp.

87

107

.

vědecké recenze

.

Harmsen
H. J. M.

Wildeboer-Veloo
a. C. M.

Raangs
G. C.

et al. (

2000

)

analýza vývoje střevní flóry u kojených a kojených dětí pomocí molekulárních identifikačních a detekčních metod

.

J.Pediatr. Gastroenterol. Nutr.
30

,

61

67

.

Salminen
.

Bouley
C

Boutron-Ruault
M.-C.

et al. (

1998

)

Functional food science and gastrointestinal physiology and function

.

Br. J. Nutr.
80

,

S147

S171

.

Harmsen
H. J. M.

Gibson
G. R

et al. (

1999

)

porovnání funkčních počtů buněk a fluorescenční hybridizace in situ pomocí specifických sond na bázi rRNA pro kvantifikaci lidských fekálních bakterií

.

FEMS Microbiol. Lette.
183

,

125

129

.

Macfarlane
G. T.

Gibson
G. R

Macfarlane
.

(

1994

)

Krátké řetězce mastných kyselin a laktátu produkce o lidské střevní bakterie pěstované v dávkové a kontinuální kultury

. V:

Krátké Řetězce Mastných Kyselin

(

Pojiva
H. J.

Cummings
J. H.

Soergel
K. H.

, Eds.), pp.

44

60

.

Kluwer Publishing

,

London

.

Allison
C

McFarlan
C

Macfarlane
G. T.

(

1989

)

Studie smíšené populace, lidské střevní bakterie pěstované v jedno a vícestupňové kontinuální kultury systémů

.

Appl. Cca. Mikrobiol.
55

,

679

683

.

močál
p.

(

1995

)

role kontinuální kultury v modelování lidské mikroflóry

.

J. Chem. Technologie. Biotechnol.
64

,

1

9

.

Veilleux
B. G.

Rowland
I.

(

1981

)

Simulace krysí střevní ekosystém pomocí dvoustupňové kontinuální kultuře systém

.

J. Gen. Microbiol.
123

,

103 –

115

.

Macfarlane
G. T.

Macfarlane
.

Gibson
G. R

(

1998

)

Validace tři fáze složené kontinuální kultura systém pro vyšetřování vlivu retenčního času na ekologii a metabolismus bakterií v lidském střevě

.

Microb. Ecol.
35

,

180

187

.

Edwards
C. a.

Parrett
.

Balmer
s. e

Wharton
B. a.

(

1994

)

Fekální krátké řetězce mastných kyselin v kojených a krmených děti

.

Acta Paediatr.
83

,

459

462

.

Cummings
J. H.

(

1983

)

Kvašení v lidském tlustém střevě: Důkazy a důsledky pro zdraví

.

Lancet
1

,

1206

1208

.

Midtvedt
T

Carlstedt-Vévoda
B.

Høverstad
T

et al. (

1986

)

Vliv perorální antimikrobiální na biotransformatory aktivitu střevní mikroflóry u zdravých předmět

.

Eur. J. Blink. Investovat.
16

,

11

17

.

Kawakami
h.

(

1997

)

Biological significance of sialic acid-containing substances in milk and their application

.

Recent Res. Dev. Agric. Biol. Chem.
1

,

193

207

.

Idota
T.

Kawakami
H.

Nakajima
I.

(

1994

)

Growth-promoting effects of N-actelylneuraminic acid containing substances on bifidobacteria

.

Biosci. Biotechnol. Biochem.
58

,

1720

1722

.

Bouhallab
.

Favrot
C

Maubois
J. L.

(

1993

)

Růst podporující činnost tryptic digest caseinomacropeptide pro Lactococcus lactis ssp. lactis

.

mléko
73

,

73 div– –

77

.

Xue
Y.

Lui
J. N.

Slunce
Z

Matný
Z

Wu
C

Zhu
D

(

2001

)

, α-Laktalbumin mutant působí jako lysozym

.

proteiny Struct. Funct. Genete.
42

,

17

22

.

Pihlanto-Lappälä
A

Marnila
P

Hubert
L

Rokka
T.

Korhonen
H. J. T.

Karpálního
M

(

1999

)

efekt α-laktalbumin a β-laktoglobulin hydrosylates na metabolické aktivity bakterie Escherichia coli JM103

.

J.Appl. Mikrobiol.
87

,

540

545

.

Petschow
B. W.

Talbott
D

(

1991

)

Reakce Bifidobacterium druhy stimulátorů růstu v lidské a kravské mléko

.

Pediatr. Res.
29

,

208

213

.

Franks
a. H.

Harmsen
H. J. M.

Raangs
G. C.

et al. (

1998

)

Variace bakteriální populace v lidské výkaly měřena pomocí fluorescenční in situ hybridizace s group specifické 16S rRNA-cílené oligonukleotidových sond

.

Appl. Cca. Mikrobiol.
64

,

3336

3345

.

Neeser
J. r. R

Golliard
M

Woltz
A

Rouvet
M

Dillmann
M. L.

Guggenheim
B.

(

1994

)

In vitro modulátor ústní bakteriální adheze k sliny potažené hydroxypatite korálky mléčné deriváty kaseinu

.

perorální Mikrobiol. Immunol.
9

,

193

201

.

By
a. E.

Adlerberth
I.

(

2000

)

kojení a střevní mikroflóru dítěte – důsledky pro ochranu proti infekční onemocnění

. In:

krátkodobé a dlouhodobé účinky kojení na zdraví dětí

(

Keletzo
b.

et al. , EDA.).

Kluwer Academic / Plenum Publishers

,

New York

.

Pelligrini
a.

Tomáš
U.

Bramaz
, N.

Hunziker
P

von Fellenberg
R

(

1999

)

Izolace a identifikace tří baktericidní domén v encefalopatie alfa-laktalbumin molekula

.

Biochim. Biophys. Acta
1426

,

439

448

.

u.

Ormission
a.

Tamm
a.

(

1993

)

fekální mastné kyseliny s krátkým řetězcem u kojených a kojených dětí

.

Acta Paediatr.
82

,

536

538

.

Wolin
M. J.

Yerry
.

Miller
T. L.

Zhang
Y.

Banky
.

(

1998

)

Změny ve výrobě ethanolu, kyseliny, a H2 z glukózy fekální flóry 16 – 158-den-staré kojené dítě

.

J.Nutr.
128

,

85

90

.

už ruský
J. L.

Kurmann
J. a.

(

1983

)

Bifidobakterie a Jejich Roli

.

Birkhauser Verlag

,

Basel

.

Tianan
J.

Savaiano
D. A.

(

1997

)

Editace střevní kvašení tím, bifidobakterie a pH in vitro

.

Dig. Deset. Věda.
42

,

2370

2377

.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.